전기 영동법
1. 원리
전기영동은 전기장 안에서 하전된 입자가 양극 또는 음극 쪽으로 이동하는 현상을 말한다. 이 때 이동하는 속도는 입자의 전하량, 크기와 모양, 용액의 pH와 점성도, 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 이온의 세기, 지지체의 종류 등 여러 가지 요인에 의해 결정된다. 따라서, 어떤 용액에서의 하전된 알맹이의 이동속도는 분자 자체의 성질에 따라서 결정된다. 그러므로 전기영동법은 아미노산, 뉴클레오티드, 단백질 들과 같은 하전된 물질들을 분리하거나 분석하는 데 매우 효과적인 수단으로 이용된다.
2. 전기영동법의 종류
(1) 이동계면 전기영동법
(Moving boundary electrophoresis)
전기영동법은 크게 두 가지 유형으로 구분할 수 있다. 하나는 이동계면 전기영동법으로서, 분리하고자 하는 분자들이 용액 내에 산재해 있는 상태에서 전류를 통하여 용매와 용액사이 또는 용액과 용액사이에 계면을 이루게 하는 전기영동법이다. 이동계면 전기영동법에서 계면의 이동은 용액에다 빛을 통과시키고 그 결과를 사진으로 만들어서 조사할 수 있다. 이동계면 전기이동법은 이론상 매우 복잡하여 결과를 해석하는 데 어려운 점이 많다는 것이 단점이다.
(2) 띠 전기영동법
(Zone electrophoresis)
이 방법에서는 적은 양의 시료용액을 거름종이, 아세트산 셀룰로오스 종이, 폴리아크릴아미드 겔, 한천 겔, 녹말 겔 따위의 지지체에 실은 후 전류를 통하여 주면 시료의 성분들이 점 또는 띠를 이루면서 이동한다. 0b전기영동그림0c을 만듦으로써 시료에 있는 성분들을 육안으로 확인 할 수 있고, 또한 광도계를 써서 정량할 수도 있다. 때 전기영동법의 경우에는 실험 목적에 따라 적당한 지지체를 선택하여야 분리를 효과적으로 할 수 있다.
1. 거름 종이
종이는 값이 싸고 사용하기 편리한 지지체이다. 그러나 분리하려는 물질들이 셀룰로오스에 흡착이 잘 되어서 전기영동그림의 띠들 사이의 경계가 선명하지 못한 것이 결점이다.
2. 아세트산 셀룰로오스
이 지지체는 아세트산 셀룰로오스의 히드록시기를 아세틸화한 것으로서 헙착성이 약하고 물질을 분리하는 데 시간이 짧다. 성분들이 거름종이에 있어서보다 깨끗이 분리되므로 검출하기가 쉽다. 또 아세트산 셀룰로오스는 여러 용매에 쉽게 용해되므로 빠르고 쉽게 회수할 수 있는 장점이다.
3. 한천 겔
이 지지체는 투명하기 때문에 특히 광도계를 쓰는 측정에 적당하며 사용이 간편하다. 특히 슬라이드를 이용하는 면역 전기영동법에 많이 사용되면 한천 겔에서 아가로펙틴(agaropectin)을 제거한 아가로오스(agarose)는 최근에 DNA, RNA 및 플라스미드 등을 분리하는 데 유용하게 쓰인다.
4. 녹말 겔
이 지지체는 녹말을 가열하여 그 알맹이가 파괴되어 겔이 형성될 때 까지 부분가수분해시킨 것이다. 녹말 겔의 구멍의 크기는 녹말의 종류, 완충용액의 종류 및 pH에 따라 결정되면 분자를 거르는 체의 구실을 한다. 한천 겔을 쓸 경우보다 시료가 많이 필요하고, 분리된 물질을 용출하기 어려운 것이 결점이지만 여러 동질효소(isoenzyme)를 분리하는 데에 널리 사용되고 있다.
5. 아크릴아미드 겔
서로 다른 그물조직을 가진 두 가지 아크릴아미드 겔을 포개어 불연속적인 층을 이루게 하여 사용한다. 이 경우 지지체의 그물조직의 구멍의 크기는 아크릴아미드의 농도를 변화시킴으로써 임의로 바꿀 수가 있다. 상층의 덜 촘촘한 겔은 단백질 같은 하전된 알맹이를 농축하는 역할을 하는 치쌓임겔(stacking gel)이므로 이 부분을 통과한 시료는 뚜렷한 때를 형성한다. 아크릴아미드 겔은 성분들의 전하에 따라서 분리할 수 있을 뿐 아니라 분자를 질량에만 의존하는 분리가 가능하다.
오늘날 아크릴아미드 겔은 단백질의 분리, 정제한 단백질의 순도 검정, 단백질의 분자량 측정 그리고 DNA의 염기 결합순서 결정 등에 이용되고 있다. 아크릴아미드 겔 전기영동법은 소량의 시료를 사용하여 단시간에 시료 혼합물을 분리할 수 있는 장점이 있다.
(3)불연속 겔 전기영동법
(Disc-gel electrophoresis)
불연속 겔 전기영동법은 아크릴아미드 겔을 이용하여 단백질들과 같은 하전된 알맹이가 매우 뚜렷한 띠들로 분리될 수 있도록 띠 전기영동법을 변형한 방법이다. 불연속 겔 전기영동법과 띠 전기영동법과의 중요한 차이점은 두 가지 겔(치쌓임 겔, 분리 겔)를 사용한다는 것과 겔 지지체와 완충용액 탱크에 사용하는 완충계들이 다르다는 것이다. 이 전기영동법을 불연속 겔 전기영동법이라고 부르는 이유는 두 겔계에 사용한 수소 이온 농도, 이온의 세기, 완충용액의 조성 및 겔 농도 등이 불연석적이기 때문이다.
불연속 겔 전기영동법에 사용하는 폴리아크릴아미드는 아크릴아미드와 N, N,N',N'-테느라에틸렌디아민(TEMED)을 첨가한다.
치쌓임겔은 아크릴아미드의 농도가 더 낮으며, 더 낮은 이온의 세기의 완충용액으로 제조되며, 따라서 pH도 더 낮다는 점에서 분리겔과 다르다. 첫 두 요인들에 의해서 단백질 분자들의 치쌓임겔에서의 이동은 분리겔에서의 이동보다 더 빨라진다. 그 이유는 첫째, 구멍 크기가 더 큼으로써(농도가 작은 겔에서) 이동하고 있는 분자들에 대한 물리적인 저항이 작기 때문이고, 둘째, 이온의 세기가 작으면 전기적 저항이 더 커지고 따라서 전기장의 세기(volts/cm)가 더 커지기 때문이다.
시료층에 있어서는 세 가지 음이온들, 즉 염하이온, 글리신 및 단백질들이 양극 쪽으로 이동하고 있다. pH8.3에서 글리신의 알짜전하는 염화이온의 전하(-1)의 몇 분의 일이다. 글리신은 염화이온보다 더 크기 때문에 더 많은 저항을 받는다. 이 두 가지 이유로 염화이온들은 글리신보다 더 빨리 이동하려 할 것이다. 그러나 전류, 즉 이온들의 흐름은 게 전체에 걸쳐서 같아야 하므로 모든 이온들은 같은 속도로 움직인다. 그러기 위해서는 전압이 염화이온 부분에 있어서보다 글리신 부분에 있어서 훨씬 더 커야 한다. 이렇게 해서 생긴 전압의 불연속성은 염화이온과 글리신 이온을 분리하게 될 것이다. 염화이온과 글리신 이온의 이동속도의 중간의 속도를 가지는 단백즐들은 글리신 이온과 염화이온이 있는 부분들 사이에 오게 될 것이다. 그뿐 아니라 단백질의 전하/질량비는 글리신 이온이나 염화이온보다 휠씬 작으므로 글리신 이온이나 염화이온 용액들이 지니는 만큼의 전류를 지니기 위해서는 매우 좁은 띠들에 농축되어야 한다. 그래서 단백즐의 띠 형성이 시작되게 된다.
(4) SDS겔 전기영동법
황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)도 역시 유용한 전기영동법의 한 가지이다. 이 방법은 특히 단백질이 단위체인지 아닌면 중합체인지를 결정할 때와, 소중합체를 구성하는 소단위체들의 수와 크기를 결정할 때 유용하게 사용한다
1. 원리
전기영동은 전기장 안에서 하전된 입자가 양극 또는 음극 쪽으로 이동하는 현상을 말한다. 이 때 이동하는 속도는 입자의 전하량, 크기와 모양, 용액의 pH와 점성도, 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 이온의 세기, 지지체의 종류 등 여러 가지 요인에 의해 결정된다. 따라서, 어떤 용액에서의 하전된 알맹이의 이동속도는 분자 자체의 성질에 따라서 결정된다. 그러므로 전기영동법은 아미노산, 뉴클레오티드, 단백질 들과 같은 하전된 물질들을 분리하거나 분석하는 데 매우 효과적인 수단으로 이용된다.
2. 전기영동법의 종류
(1) 이동계면 전기영동법
(Moving boundary electrophoresis)
전기영동법은 크게 두 가지 유형으로 구분할 수 있다. 하나는 이동계면 전기영동법으로서, 분리하고자 하는 분자들이 용액 내에 산재해 있는 상태에서 전류를 통하여 용매와 용액사이 또는 용액과 용액사이에 계면을 이루게 하는 전기영동법이다. 이동계면 전기영동법에서 계면의 이동은 용액에다 빛을 통과시키고 그 결과를 사진으로 만들어서 조사할 수 있다. 이동계면 전기이동법은 이론상 매우 복잡하여 결과를 해석하는 데 어려운 점이 많다는 것이 단점이다.
(2) 띠 전기영동법
(Zone electrophoresis)
이 방법에서는 적은 양의 시료용액을 거름종이, 아세트산 셀룰로오스 종이, 폴리아크릴아미드 겔, 한천 겔, 녹말 겔 따위의 지지체에 실은 후 전류를 통하여 주면 시료의 성분들이 점 또는 띠를 이루면서 이동한다. 0b전기영동그림0c을 만듦으로써 시료에 있는 성분들을 육안으로 확인 할 수 있고, 또한 광도계를 써서 정량할 수도 있다. 때 전기영동법의 경우에는 실험 목적에 따라 적당한 지지체를 선택하여야 분리를 효과적으로 할 수 있다.
1. 거름 종이
종이는 값이 싸고 사용하기 편리한 지지체이다. 그러나 분리하려는 물질들이 셀룰로오스에 흡착이 잘 되어서 전기영동그림의 띠들 사이의 경계가 선명하지 못한 것이 결점이다.
2. 아세트산 셀룰로오스
이 지지체는 아세트산 셀룰로오스의 히드록시기를 아세틸화한 것으로서 헙착성이 약하고 물질을 분리하는 데 시간이 짧다. 성분들이 거름종이에 있어서보다 깨끗이 분리되므로 검출하기가 쉽다. 또 아세트산 셀룰로오스는 여러 용매에 쉽게 용해되므로 빠르고 쉽게 회수할 수 있는 장점이다.
3. 한천 겔
이 지지체는 투명하기 때문에 특히 광도계를 쓰는 측정에 적당하며 사용이 간편하다. 특히 슬라이드를 이용하는 면역 전기영동법에 많이 사용되면 한천 겔에서 아가로펙틴(agaropectin)을 제거한 아가로오스(agarose)는 최근에 DNA, RNA 및 플라스미드 등을 분리하는 데 유용하게 쓰인다.
4. 녹말 겔
이 지지체는 녹말을 가열하여 그 알맹이가 파괴되어 겔이 형성될 때 까지 부분가수분해시킨 것이다. 녹말 겔의 구멍의 크기는 녹말의 종류, 완충용액의 종류 및 pH에 따라 결정되면 분자를 거르는 체의 구실을 한다. 한천 겔을 쓸 경우보다 시료가 많이 필요하고, 분리된 물질을 용출하기 어려운 것이 결점이지만 여러 동질효소(isoenzyme)를 분리하는 데에 널리 사용되고 있다.
5. 아크릴아미드 겔
서로 다른 그물조직을 가진 두 가지 아크릴아미드 겔을 포개어 불연속적인 층을 이루게 하여 사용한다. 이 경우 지지체의 그물조직의 구멍의 크기는 아크릴아미드의 농도를 변화시킴으로써 임의로 바꿀 수가 있다. 상층의 덜 촘촘한 겔은 단백질 같은 하전된 알맹이를 농축하는 역할을 하는 치쌓임겔(stacking gel)이므로 이 부분을 통과한 시료는 뚜렷한 때를 형성한다. 아크릴아미드 겔은 성분들의 전하에 따라서 분리할 수 있을 뿐 아니라 분자를 질량에만 의존하는 분리가 가능하다.
오늘날 아크릴아미드 겔은 단백질의 분리, 정제한 단백질의 순도 검정, 단백질의 분자량 측정 그리고 DNA의 염기 결합순서 결정 등에 이용되고 있다. 아크릴아미드 겔 전기영동법은 소량의 시료를 사용하여 단시간에 시료 혼합물을 분리할 수 있는 장점이 있다.
(3)불연속 겔 전기영동법
(Disc-gel electrophoresis)
불연속 겔 전기영동법은 아크릴아미드 겔을 이용하여 단백질들과 같은 하전된 알맹이가 매우 뚜렷한 띠들로 분리될 수 있도록 띠 전기영동법을 변형한 방법이다. 불연속 겔 전기영동법과 띠 전기영동법과의 중요한 차이점은 두 가지 겔(치쌓임 겔, 분리 겔)를 사용한다는 것과 겔 지지체와 완충용액 탱크에 사용하는 완충계들이 다르다는 것이다. 이 전기영동법을 불연속 겔 전기영동법이라고 부르는 이유는 두 겔계에 사용한 수소 이온 농도, 이온의 세기, 완충용액의 조성 및 겔 농도 등이 불연석적이기 때문이다.
불연속 겔 전기영동법에 사용하는 폴리아크릴아미드는 아크릴아미드와 N, N,N',N'-테느라에틸렌디아민(TEMED)을 첨가한다.
치쌓임겔은 아크릴아미드의 농도가 더 낮으며, 더 낮은 이온의 세기의 완충용액으로 제조되며, 따라서 pH도 더 낮다는 점에서 분리겔과 다르다. 첫 두 요인들에 의해서 단백질 분자들의 치쌓임겔에서의 이동은 분리겔에서의 이동보다 더 빨라진다. 그 이유는 첫째, 구멍 크기가 더 큼으로써(농도가 작은 겔에서) 이동하고 있는 분자들에 대한 물리적인 저항이 작기 때문이고, 둘째, 이온의 세기가 작으면 전기적 저항이 더 커지고 따라서 전기장의 세기(volts/cm)가 더 커지기 때문이다.
시료층에 있어서는 세 가지 음이온들, 즉 염하이온, 글리신 및 단백질들이 양극 쪽으로 이동하고 있다. pH8.3에서 글리신의 알짜전하는 염화이온의 전하(-1)의 몇 분의 일이다. 글리신은 염화이온보다 더 크기 때문에 더 많은 저항을 받는다. 이 두 가지 이유로 염화이온들은 글리신보다 더 빨리 이동하려 할 것이다. 그러나 전류, 즉 이온들의 흐름은 게 전체에 걸쳐서 같아야 하므로 모든 이온들은 같은 속도로 움직인다. 그러기 위해서는 전압이 염화이온 부분에 있어서보다 글리신 부분에 있어서 훨씬 더 커야 한다. 이렇게 해서 생긴 전압의 불연속성은 염화이온과 글리신 이온을 분리하게 될 것이다. 염화이온과 글리신 이온의 이동속도의 중간의 속도를 가지는 단백즐들은 글리신 이온과 염화이온이 있는 부분들 사이에 오게 될 것이다. 그뿐 아니라 단백질의 전하/질량비는 글리신 이온이나 염화이온보다 휠씬 작으므로 글리신 이온이나 염화이온 용액들이 지니는 만큼의 전류를 지니기 위해서는 매우 좁은 띠들에 농축되어야 한다. 그래서 단백즐의 띠 형성이 시작되게 된다.
(4) SDS겔 전기영동법
황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)도 역시 유용한 전기영동법의 한 가지이다. 이 방법은 특히 단백질이 단위체인지 아닌면 중합체인지를 결정할 때와, 소중합체를 구성하는 소단위체들의 수와 크기를 결정할 때 유용하게 사용한다
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