조직병리검사 표본제작과정
1. 검체의 채취 8. Cleaning (투명)
2. 육안 조직검사 9. Inpregnation or Infilteration (침투)
3. Fixation (고정) 10. Embedding (포매)
4. Decalcification (탈회) 11. Trimming (삭정)
5. Tissue capsuling (조직 교갑) 12. Microtome cutting (박절)
6. washing (수세) 13. Stain (염색)
7. Dehydration (탈수) 14. Mounting (봉입)
Special stain
1. Collagen fiber염색 6. 탄수화물 염색
2. Reticulum fiber 염색 7. Glycogen 염색
3. Basement membrane 염색 8. Mucicarmine(중성점액) 염색
4. Elastic fibers. 산성점액 염색 10. Amyloid 염색
5. Muscle 염색 11. Lipid 염색
조직병리검사 표본제작과정
⑴ 조직점체의 접수 (임상진료 각 과에서 절개된 장기나 조직검체)
⑵ 육안조직검사 (육안으로 장기나 조직의 이상여부를 확인하고
검경을 위한 표본제작용 검체물의 체취)
⑶ 검체를 고정 (검체를 고정액에 담궈 고정한다.)
⑷ Tissue capsuling (인식라벨과 조직을 조직 캡슐에 싸는 작업)
⑸ 수세 (흐르는 물로 고정액 제거)
⑹ 자동 조직 과정 처리기 (탈수,투명,침투)
⑺ 포매 (파라핀 block을 제작한다. 삭정도 포함)
⑻ 박절 (Microtome으로 4-6micron 박절)
⑼ Slide 건조 (60℃ oven에 1시간 동안 건조시킨다.)
⑽ 염색(일반 H&E stain alc Special stain)
⑾ 봉입(봉입제로 봉입 하여 조직 표본의 손실을 방지)
⑿ 판독 (현미경으로 검경하여 판독)
⒀ 자료 정리 (판독이 끝난 Slide와 Paraffin block을 정리함)
1.검체의 채취
① Biopsy(생검): 살아 있는 생체로부터 조직을 절취하는 것
(검체의 크기가 작다. 1~2㎜)
② Autopsy(부검): 사체로부터 검체를 채취하여 병리학
연구가 목적(Necropsy, 사검)
1) 생검의 종류
⑴ Endoscopic(fibroscopic) biopsy (내시경검사)
① 내시경을 이용해서 병소의 일부를 절취
② 식도,위, 십이지장 직장등의 소화기계와 기관지 등에서 의심되는
병변채취
③ 조직 크기 1-3㎟, 1-9개정도 채취를 한다.
⑵ Needle biopsy (침생검)
① 이중으로 된 바늘 형태의 기구로 절취
② 신장, 간, 갑상선,늑막,전립선, 골수 등을 가는 침으로 찔러 채취
③ 조직 크기는 1-2cm X 2㎟ 내외
⑶ Punch biopsy (천자생검)
① 피부나 자궁경부등 외부에 자극을 받기 쉬운 즉 노출된 조직을
punch 절취
② 채취조직의 크기는 1 X 0.5 X 0.5cm내외(2~5㎜ 크기)
⑷ Cutting(소파생검)
소파수술 도구인 Curett으로 자궁내막, 농양벽등의 조직을 떠내는
방법 . 조직의 크기는 1-5cc내외
⑸ Surgical biopsy(외과적 생검)
① 피부 림프절, 유선(유방), 골격근등의 조직을 외과적 수술에 의
해 얻는 방법
* incional biopsy - 병소의 일부만을 절취
- 대상: 전 병소가 동일하다고 판단되는 표면
에서 만져지는 조직괴(mass)
* excisional biopsy - 병소의 전부를 절취
- 치료, 진단 목적
⑹ 골 생검 (bone biopsy)
- 외과적 수술을 통해 각종 뼈조직을 얻는다. 고정후 탈회과
정을 거쳐야 한다.
⑺ 구강 병리검사(Oral biopsy)
- 이 잇몸 치아의 이상이 잇을 때 구강외과적 수술로 얻음
⑻ Cancer specimen (암검체)
- 수술로 제거된 커다란 암조직으로서 암부위 및 암주위 조직
을 포함
2. 육안 조직검사
① Gross cutting - 표본을 관찰할 수 있도록 적절한 크기는 잘라
내는 것
② Gross fiding - 육안 소견 및 병소를 관찰하고 표본 제작 부위
를 선정하는 과정
1) 육안 검사의 원칙
- 병변 부위와 정상조직의 양쪽부위가 모두 포함되게 한다.
- 검체가 작은 경우에는 전부 포매한다.
- 절취할 조직편의 크기 및 두께
① 크기: 22X40cm in size 이내
② 두께: 3-5mm in thickness
- 조직의 부위별로 병변을 선택
- 각 장기는 육안조직검사 지침에 따른다.
- 뼈조직은 칼로 치지 말고 의료용 저속도 톱으로 외력을 주지 않
고 절단
- 육안소견검사시 조직의 크기 무게,색갈,모양,경도 병변부위의
크기 등을 기술
- 포매 방향 표시 - ink 먹으로 표시
- 조직편의 표시: label
- 조직편의 분실 혼동 방지
2) 대표적인 조직의 Gross cutting 방법
⑴ Stomach
- Endoscopic biopsy: 거즈나 얇은 종이에 싸서 Label부착
- Gastrectomy: 대만부를 잘라 절개한 후콜크판에 핀으로고정
→ 고정 (autolysis를 방지하기 위해서 이다.)
⑵ Rectum (직장): 가위로 관을 따라 잘라 평면으로 만들고 이를
콜크판에 핀으로 고착
⑶ Uterus(자궁): T자로 절개한 후 고정 부위별로 채취
⑷ Kidney
- needle biopsy: EM, LM,IFM용으로 세분
검체의 피질이 반드시 포함되도록 한다.
- Nepherectomy: 신장 절개
⑸ Breast
- needle biopsy or incisional biopsy
- mastectomy
⑹ 간,비장(liver, Spleen) - 간은 충실성 조직이기 때문에 고정
기간이 길어진다.
따라서 특별히 얇게 자른다.
⑺ Lung - 폐에는 공기가 들어 있어 고정이 잘 안되므로주사기로
기관지를 따라 formalin을 주입하여
내부외부고정을 완벽히 한 다음 표본제작
⑻ Appendix .tube(맹장 관상조직) - 횡단면 2개 종단면 1개
⑼ Muscle Nerve(근조지과 신경조직) - 횡단면, 종단면 제작
⑽ Skin - Punch biopsy or incisional biopsy. 표피가 포함 되도
록 잘라야 한다.
⑾ Lyphnode (림프절): 면역장기
① 목적 - 전이여부를 알기위해
- 종양인지의 확인
* incisional biopsy - 종양인지 아닌지를 보기 위해서
아무렇게나 잘라도 됨
* Radical ~tomy -주변의 임파절까지 모두 절치하는 수술
반드시 bisected 한 후 1개만 선정
∴ 임파절이 전이가 잘 되기 때문
⑿ bone - 먼저 고정한 후 bone cutter로 두께 4mm로 잘라내고
탈회 탈회완료후 크기 2X4cm로 잘라
여러 개의 표본을 제작
⒀ Eyeball(안구) - 수정체, 망막, 안신경이 다 포함되도록 자른
후 표본제작
3. Fixation <고정>
: 조직을 물리ㆍ화학적 방법으로 처리하여 이용 조직의 사후 변화를
방지하고 형태ㆍ구조적, 분자적 구성이 생체에서와 같은 상태로
유지되도록 인위적으로 처리하여 관찰에 적합하도록 처리하는 과
정
※ 목적
①Autolysis(자가융해)를 막고 세균에 의한 부폐를 막는다.
(효소, 단백질 기능 불능→세균 사멸)
②가능한한 살아 있는 상태와 유사하게 보존
③구성성분의 유실 방지(경화, 단백응고)
④시약, 약품에 대한 저항성(형태변화 최소화)
⑤매염작용
※ 원리: 세포의 단백질 성분을 물리적 또는 화학적으로 응고 또는
변성시킴으로서 세포구성성분을 불용성으로
변성 시키는 것이다.
1) 고정의 방법
⑴ 화학적 방법
① 가교형(Cross-lingkage)
: 단백질의 아미노기(NH2) + 알데하드기(-CHO)
저분자량 물질의 보존이 우수
- formaldehyde
- glutaraldehyde
- osmium tetroxide
② 응고ㆍ침전형(Precipitation)
: 탈수, 응고(단백질 변성), 고정시 단백뇨는 융해되지 않음.
- Mercuric chloride
- Potassium dichromate
- Chromic acid
- Picric acid
- acetic acid
- ethyl alchol
- acetone
⑵ 고정 방법에 따라
- 침적법: 고정액에 담궈 둔다. (크기가 작은 조직)
- 관류법: 혈관이나 기관지를 통해 주사기로 고정액을 주입
(장기 전체: 폐, 뇌, 췌장, 심장 등)
⑶ 물리적 방법
① 가열
② 동결 - 신속한 진단 또는 특정 물질 검출시
⑷ 고정액의 작용
① 자가융해 방지: 분해효소의 작용을 불활성화, 분해효소의
표적 성분을 화학적으로 변성
② 부패방지: 살균또는 세균의 증식을 억제
③ Hardening(경화작용): 유동적인 원형질을 반고체로 만든다.
표본제작 과정 중 발생하는 조직의 손
상을 방지
④ Mordanting(매염작용): 염색단계에서 염색이 잘 되게 한다.
2) 고정제의 특성
⑴ Formaldehyde
① 냄새 및 자극성이 강한 무색의 기체 (환기 시설이 필요)
② 용해도: 물에 37%-40% →formalin (Concentration
formalin: 37-40%)
③ 장점: 강한 살균력 (방부제로 많이 쓰임)
④ 단점: 단백질을 변성 (교차결합)
- formalin을 장시간 보존할 경우 산소와 결합하여
산화가 되어 formic acid(개미산)을 형성한다.(pH가
낮아진다.)
- Hb와 결합, 흑색의 인공색소(formalin)형성
⑵ Glutaraldehyde
① aldehyde기가 2개가 존재하는 무색의 액체
② 전자 현미경 표준 고정제(농도: 2~3%, pH 7.2~7.5)
③ 갈색병, 냉장보관
⑶ Osmium tetroxide(Osmic acid, OsO4)
① 연한 황색(노란색) 결정체
② 단백질로 탄수화물 및 지질고정에 우수
③ 전자현미경 시료고정의 2차 고정제로 사용
④ 밀폐된 용기에 보관(증발 물질이 인체에 유해, 환기 시설
내에서 사용)
⑤ 불포화 지질을 흑색으로 만드는 가교형성 방식 고정제
⑷ Mercuric chloride (HgCl2, 승홍, 염화 제2수은)
① 백색 결정체 유독성이 강하다.
② 용해도: 물7%,알콜33%
③ 장점- 강력한 단백질 응고력 및 강한 매염작용, 세포질 염색
에 양호
④ 단점- 조직의 침투가 느리고, 조직을 경화 및 위축(단점),
금속 부식성(금속 제품 사용금지)
- 승홍 결정 침착(흑갈색의 인공색소)- 염색 전에 승홍
색소 제거
⑤ 수은 색소 제거법(박절하여 염색전에 제거)
: 수은 색소+Iodine →Mercuric iodine(알콜에 작용)
Iodine색(갈색)+Sodium thiosulfate →무색
⑸ Potassium dichromate(K2Cr2O7, 중크롬산 칼륨)
① 오랜지색 결정체, 음고침전형 고정제
② 조직과 방응하여 불용성의 침전물 형성 가능, 고정 후
반드시 수세(흐르는 물에 12~24시간정도)
⑹ Chromic acid(H2CrO4)
① 갈색(보라색) 결정체
② 응고 침전형 고정제
⑺ Picric acid(2, 4, 6 - trinitrophenol)
① 노란색 결정체
② 용해도: 물(1%), 알콜(5%)
⑻ Acetic acid(CH3COOH, 초산)
① 무색의 액체
② 교원 섬유 이완 효과
⑼ Ethyl alcohol(C2H5OH)
① 무색 투명한 휘발성 액체
② 장점- 당원 핵산효소 증명에 우수
③ 단점- 강력한 탈수작용(단백질 응고), 조직의 위축
⑽ Acetone(CH3COCH3)
① 무색 액체, 휘발성, 인화성
② 조직내 효소 증명에 이용
3)고정제의 종류
⑴ Formalin계 고정액
① 10% formalin sol
ⅰ. 가장많이 사용
ⅱ. 제조가 간단하고 가격이 저렴하다.
ⅲ. 적정 pH 7.0 (고정효과최대)
ⅳ. 장시간 방치시 pH가 내려간다.
- pH 5.6 이하시 포르말린 색소를 형성하는데 이 색소는
조직내 적혈구가 파괴되어 갈색의
포르말린 색소가 형성하는 것인데, 이 pH를 중화하기
위해 중화제(Calcium Carbonate,
Magnesium Carbonate)를 사용할 수 있다.
ⅴ. 지방 고정에 우수하며, 살균력, 침투력이 좋다.
ⅵ. formalin에 의한 고정이 염기성 염료와 조직의 조직화학
적 성분과의 친화력을 증가 시키는 이유는
조직의 amino기와 결합하기 때문이다.
ⅶ. Formalin conc 10ml + D/W 90ml
② 10% Neutral buffer formalin(10% NBF)
- 증류수 대신 완충액(인산)을 첨가하여 pH를 조절한다.
⑵ Picric acid계 고정액
① Boin sol
ⅰ. picric acid + formalin conc + acetic acid(G.A.A)
ⅱ. Masson's trichrome 염색시 매염제로 사용(56℃/1시간)
ⅲ. 골수(Bone marrow) 조직 고정, 탈회에 사용
② D.B(Duboscg-brasil)
ⅰ. 신장(Kidney)조직을 고정시 사용
ⅱ. 조직이 노랗게 착색됨으로 흐르는물에10분정도수세한다.
③ Rossman
④ Gendre
⑶ Mercuric chloride계 고정액
① Zenker's sol
ⅰ. Mercuric chloride + Pot. dichromate + Sod. sulfate + D.W
ⅱ. 사용직전에 G.A.A(빙초산)첨가
ⅲ. 조혈장기에 우수, 결합조직, 교정시간 유의 (너무 길지 않게)
ⅳ. PTHA 염색시 매염제로 사용
ⅴ. 수은 색소 제거하여 사용
② helly's sol
ⅰ. Zenker's sol + Formalin conc
ⅱ. 수은 색소 제거하여 사용
③ heiden-keins susa sol
ⅰ. 수은 색소 제거하여 사용
④ Maximow sol
ⅰ. 수은 색소 제거하여 사용
⑤ Schaudinn sol
ⅰ. 수은 색소 제거하여 사용
⑥ B-5 sol - 악성 림프종 진단 목적으로 림프절 고정에 사용
⑷ Pot. dichromate계 고정액
① Muller sol
ⅰ. 크롬 친화성 조직 증명(부신 수질 세포: 크로마틴 과립
(세포질내))
ⅱ. 12-24시간(조정후 수세)
② Regaud(Moller) sol
③ Orth sol
⑸ Osmium tetroxide(Osmic acid, OsO4)계 고정액
① Flemming sol
ⅰ. 유색
ⅱ고정후 수세
ⅱ. 2%OsO4 + Chromium trioxide + Acetic acid
② Champy sol
ⅰ. Flemming sol - acetic acid + pot.dichromate
⑹ 기타 고정액
① Carnoy sol
ⅰ. Absolute alcohol + Chloroform + G.A.A
ⅱ. glycogen, 핵산 Nissle body 고정에 우수
ⅲ. 단점은 심한조직의 위축을 초래한다.
ⅳ. 고정시간에 유의해야 한다.(3-4시간 이내, 신속 표
본 제작시)
ⅴ. 물이 포함되지 않은 고정액, 수세가 불필요한 고정액
② Kaiserling sol
ⅰ. 3단계로 나눠져 있다.
ⅱ. 전시 목적 고정(본래의 색 유지)
전자현미경 시료 고정액
☆ Glutaraldehyde - 1차 고정액 (전 고정)
☆ Osmium tetroxide - 2ck 고정액 (후 고정)
1. 박물용 고정액 과정
: 장기를 장시간 보존하면서 전시 교육용으로 사용할 때
① Kaiserling sol I: 1-5일 일반적인 고정
② Kaiserling sol II: 1-6일간 색 복원
③ Kaiserling sol III: 영구 보존
2. 고정
⑴ 즉시 고정 원칙
① 떼어낸 즉시 고정액에 넣는 것이 원칙
② 부득이한 경우 냉장고 보관
③ (일시적) 생리식염수 거즈를 덮는다.
⑵ 고정용기
① 입구가 큰 용기 사용
② 미소조직- 투명한 용기 사용
⑶ 고정액량 : 조직용적의 10-20배
⑷ 고정액의 침투율
① 약 1mm/hr
② Pot. dichromate 1.33mm/hr로 빠르다.
⑸ 온도
① 일반고정: 실온
② 전자 현미경 고정: 0 - 4℃
③ 조직 화학적 고정: 0 - 4℃
④ 응급 신족 고정: 동결 또는 점진적 가열
⑹ pH
① 인체의 pH와 흡사하도록 한다.
② 전자 현미경 고정시 완충액 사용해서 pH 고정
4. 탈회(decalcification)
: 뼈조직, 치아 석화화된 조직 (결핵 병소)등 고정 완료 후 조직
과정 단계를 거치기 전에 Calcium 성분을
제거하여 조직을 연화 => 탈회
< 탈회 원리>
1. 산(acid) 용액에 의한 탈회법
⑴ 원리: 산(acid) 용액은 칼슘 염에 작용해서 칼슘이온을 해리(유
리) 시키며 유리된 칼슘이온은 음이온과 결합하여 용해성
칼슘염을 형성 (Capo4, CaCo3 - 불용성 칼슘염)
⑵ 무기산 이용: 염산, 초산, 질산, 황산, formic acid, Nitric
acid 등
- 산성용액의 종류
① Nitric acid 5-7% 수용액
저농도 → 조직의 팽창
고농도 → 염색성 저하
질산 수용액은 장시간 방치하면 아질산으로 변성될
수가 있다.(탈회능 및 염색성 저하)
* 사용할 때 반드시 탈회액을 매일 신선한 것으로 교환해
주어야 함
② HCl
③ TCA 용액 - 5-10% 수용액
- 탈회속도 및 염색성 우수 조직 손상이 심하다.
④ Formic acid - 탈회능이 약하다.
- 조직 손상이 적다.
2. 완충액 또는 킬레이트에 의한 탈회법
※ Chelating agent-EDTA(금속이온과 결합할 수 있는 유기화합물)
① 조직에 대한 상해가 적고 구조 및 염색성 보존이 우수
② 탈회속도가 느리다.
③ 조직 화학 검사에 이용 (조직내 효소 또는 기타 화학 성분
검출시)
④ Gr. 게의 집게발 의미
3. 이온 교환 수지 탈회법
① ion-exchange-resin: 수지 표면의 이온이 다른 이온과 치환되
는 성질을 이용 즉 유리된 칼슘이온을 수
지로 흡수 치환되면서 제거
② 탈회액: 10% formic acid 80ml
③ Ion exchange resin
4. 전기분해 탈회법 (신속하게 탈회 할 수 있다.)
① 준비물: 유리 그릇, 탄소봉, 백금선(+) 전극(직류), 전해질
용액(탈회액, Formic acid), Conc HCl, D.W
② 탈회시 온도: 30-45℃
<탈회 과정>
1). 탈회조직의 절취: 전기톱 이용 (조직이 파괴되지 않도록)
2). 고정: 조직의 손상을 막기위해 반드시 탈회전 고정
3). 탈회: 탈회할 조직을 탈회용액에 담근다.(조직을 실에 묶어 용기
에 매달아 둔다.)
☆ 매일 새 용액으로 갈아준다.
4). 탈회촉진: 가온, 교반 (진탕), 현수
5). 탈회 완료 시점의 결정
6). 완료시점의 파악
① 물리적 방법 - Pin, 칼로 배거나 찔러본다.
② 화학적 방법 - 시험관내에서 탈회액에 5% Sod. Ammonium
oxalate
첨가하여 혼탁여부를 알아본다.
☆ 혼탁시- 칼슘이 남아있다.
7). 중화
① 5% Sod. sulfate
② 5% Lithium Carbonate
8). 7% alcohol
9). 수세
5. Tissue capsuling (조직 교갑)
① 고정이 완료된 조직과 탈회가 완료된 조직은 각각의 인식
라벨이 늘 같이 존재해야 한다.
② 조직을 안전하게 보호하는 tissue capsule에 넣어 조직표본
제작 과정을 거치게 된다.
③ Tissue tek의 Cassette는 상부에 연필로 적도록 되어있고
이 cassette에 그대로 포매하게 되어있다.
④ 인식 라벨을 연필로 적는다.
6. washing(수세)
① 고정액을 제거하기 위해서 흐르는 물로 수세한다.
(조잭내 산 또는 알카리 성분 제거)
② 흐르는 물에 하루밤 처리(탈수 과정부터 재개)
③ 조직의 유실 및 번호표 유실을 주의
7. Dehydration(탈수)
① 확산작용에 의해 물을 밀어냄 (탈수원리)
② 물과 잘 섞이는 물질로 조직내의 수분을 점진적으로 대치하는
과정
③ paraffin은 수세한 후 조직 내부에 남아있는 수분과 혼합되지
않으므로 이를 제거
⑴ 종류
① ethyl alcohol(ethanol)
② isoprophyl alcohol(isoprophanol)
③ amyl alcohol(pentanol)
④ acetone(도특한 자극성 냄새 휘발성 강함)
⑤ ethylene glycol(cellosolve)
⑥ tetrohydrofuran
⑦ buthyl alcohol(buthanol): 투명과정을 거치지 않아도 된다.
(투명과 침투과정을 동시에 거친다.)
⑧ Dioxine: 투명과정을 거치지 않아도 된다.
(투명과 침투과정을 동시에 거친다.)
⑵ 탈수과정
① 저농도 알콜 ⇒ 고농도 알콜(80%알콜⇒100%알콜, 7~8단계)
② 이유: 농도차에 의한 급격한 확산으로 인한 조직의 손상을 방
지 (단백이 응고되는 알콜농도-70%)
③ 가장 이상적인 탈수란: 동적 평형상태가 될 때(물과알콜간의
동적 평형상태)
④ 탈수 완료 단계: 조직에 비결합수가 약 3-4% 수분이 포함 상태
⑶ 무수알콜 제조법
① 무수 황상동(CuSO4) ⇒ 회백색 흡수성이 강하다.
② 물이 희석된 알콜 + CuSO4 ⇒ 무수알콜 + 청색 황산동
③ 청색 황산동 ⇒ 연한 황산동 ⇒ 회백색 황산동
100℃ 200℃
8. Cleaning (투명)
: 탈수제와 파라핀 모두에 잘 섞이는 물질로 탈수제를 대치시키
는 과정
⑴ 투명제란: Alcohol 탈수 과정을 거친 조직에서 alcohol을 제거하
여 주며 침투제인 Paraffin과 잘 혼합될 수 있는 물질
⑵ 투명제의 조건
① Alcohol 제거능력이 신속해야 한다.
② 조직을 너무 경화시켜 서는 안된다.
③ 독성이 적을수록 좋다.
④ 가연성이 낮을수록 좋다.
⑤ 가격이 저렴해야 한다.
⑶ 투명제의 종류
① Xylene - 투명제로 검사실에서 널리 이용된다.
- 투명을 잘 하게 위해서는 조직 두께가 3-4mm 초과하
지 말아야 하며, 이 경우 1시간 정도로
2-3단계를 거쳐야 한다.
- 이 용액은 alcohol을 제거하는 작용이 매우 빠른 우수
한 투명제 값도 저렴 paraffin 제거
및 용해 기능도 좋다.
- 단 조직을 오래 담궈둘 경우 조직이 경화되어 박절하
기가 어렵다.
- Xylene의 증기는 유독 하므로 환기를 잘 하거나 fume
fool로 제거하여야 한다.
② Toluene
③ Benzene
④ Chloroform
⑤ Cerdar wood oil
⑥ carbon tetrachloride
⑦ aniline oil
⑧ histoclear
⑨ pyridine
⑷ 조직을 처리하는 시간
① 2단계, 1시간~1시간30분(3시간)
② 장시간 처리시 조직이 단단해 진다.
⑸ 물+알콜+Xylene ⇒ 혼탁(우유색): 탈수 과정이 충분해야 한다.
1. 검체의 채취 8. Cleaning (투명)
2. 육안 조직검사 9. Inpregnation or Infilteration (침투)
3. Fixation (고정) 10. Embedding (포매)
4. Decalcification (탈회) 11. Trimming (삭정)
5. Tissue capsuling (조직 교갑) 12. Microtome cutting (박절)
6. washing (수세) 13. Stain (염색)
7. Dehydration (탈수) 14. Mounting (봉입)
Special stain
1. Collagen fiber염색 6. 탄수화물 염색
2. Reticulum fiber 염색 7. Glycogen 염색
3. Basement membrane 염색 8. Mucicarmine(중성점액) 염색
4. Elastic fibers. 산성점액 염색 10. Amyloid 염색
5. Muscle 염색 11. Lipid 염색
조직병리검사 표본제작과정
⑴ 조직점체의 접수 (임상진료 각 과에서 절개된 장기나 조직검체)
⑵ 육안조직검사 (육안으로 장기나 조직의 이상여부를 확인하고
검경을 위한 표본제작용 검체물의 체취)
⑶ 검체를 고정 (검체를 고정액에 담궈 고정한다.)
⑷ Tissue capsuling (인식라벨과 조직을 조직 캡슐에 싸는 작업)
⑸ 수세 (흐르는 물로 고정액 제거)
⑹ 자동 조직 과정 처리기 (탈수,투명,침투)
⑺ 포매 (파라핀 block을 제작한다. 삭정도 포함)
⑻ 박절 (Microtome으로 4-6micron 박절)
⑼ Slide 건조 (60℃ oven에 1시간 동안 건조시킨다.)
⑽ 염색(일반 H&E stain alc Special stain)
⑾ 봉입(봉입제로 봉입 하여 조직 표본의 손실을 방지)
⑿ 판독 (현미경으로 검경하여 판독)
⒀ 자료 정리 (판독이 끝난 Slide와 Paraffin block을 정리함)
1.검체의 채취
① Biopsy(생검): 살아 있는 생체로부터 조직을 절취하는 것
(검체의 크기가 작다. 1~2㎜)
② Autopsy(부검): 사체로부터 검체를 채취하여 병리학
연구가 목적(Necropsy, 사검)
1) 생검의 종류
⑴ Endoscopic(fibroscopic) biopsy (내시경검사)
① 내시경을 이용해서 병소의 일부를 절취
② 식도,위, 십이지장 직장등의 소화기계와 기관지 등에서 의심되는
병변채취
③ 조직 크기 1-3㎟, 1-9개정도 채취를 한다.
⑵ Needle biopsy (침생검)
① 이중으로 된 바늘 형태의 기구로 절취
② 신장, 간, 갑상선,늑막,전립선, 골수 등을 가는 침으로 찔러 채취
③ 조직 크기는 1-2cm X 2㎟ 내외
⑶ Punch biopsy (천자생검)
① 피부나 자궁경부등 외부에 자극을 받기 쉬운 즉 노출된 조직을
punch 절취
② 채취조직의 크기는 1 X 0.5 X 0.5cm내외(2~5㎜ 크기)
⑷ Cutting(소파생검)
소파수술 도구인 Curett으로 자궁내막, 농양벽등의 조직을 떠내는
방법 . 조직의 크기는 1-5cc내외
⑸ Surgical biopsy(외과적 생검)
① 피부 림프절, 유선(유방), 골격근등의 조직을 외과적 수술에 의
해 얻는 방법
* incional biopsy - 병소의 일부만을 절취
- 대상: 전 병소가 동일하다고 판단되는 표면
에서 만져지는 조직괴(mass)
* excisional biopsy - 병소의 전부를 절취
- 치료, 진단 목적
⑹ 골 생검 (bone biopsy)
- 외과적 수술을 통해 각종 뼈조직을 얻는다. 고정후 탈회과
정을 거쳐야 한다.
⑺ 구강 병리검사(Oral biopsy)
- 이 잇몸 치아의 이상이 잇을 때 구강외과적 수술로 얻음
⑻ Cancer specimen (암검체)
- 수술로 제거된 커다란 암조직으로서 암부위 및 암주위 조직
을 포함
2. 육안 조직검사
① Gross cutting - 표본을 관찰할 수 있도록 적절한 크기는 잘라
내는 것
② Gross fiding - 육안 소견 및 병소를 관찰하고 표본 제작 부위
를 선정하는 과정
1) 육안 검사의 원칙
- 병변 부위와 정상조직의 양쪽부위가 모두 포함되게 한다.
- 검체가 작은 경우에는 전부 포매한다.
- 절취할 조직편의 크기 및 두께
① 크기: 22X40cm in size 이내
② 두께: 3-5mm in thickness
- 조직의 부위별로 병변을 선택
- 각 장기는 육안조직검사 지침에 따른다.
- 뼈조직은 칼로 치지 말고 의료용 저속도 톱으로 외력을 주지 않
고 절단
- 육안소견검사시 조직의 크기 무게,색갈,모양,경도 병변부위의
크기 등을 기술
- 포매 방향 표시 - ink 먹으로 표시
- 조직편의 표시: label
- 조직편의 분실 혼동 방지
2) 대표적인 조직의 Gross cutting 방법
⑴ Stomach
- Endoscopic biopsy: 거즈나 얇은 종이에 싸서 Label부착
- Gastrectomy: 대만부를 잘라 절개한 후콜크판에 핀으로고정
→ 고정 (autolysis를 방지하기 위해서 이다.)
⑵ Rectum (직장): 가위로 관을 따라 잘라 평면으로 만들고 이를
콜크판에 핀으로 고착
⑶ Uterus(자궁): T자로 절개한 후 고정 부위별로 채취
⑷ Kidney
- needle biopsy: EM, LM,IFM용으로 세분
검체의 피질이 반드시 포함되도록 한다.
- Nepherectomy: 신장 절개
⑸ Breast
- needle biopsy or incisional biopsy
- mastectomy
⑹ 간,비장(liver, Spleen) - 간은 충실성 조직이기 때문에 고정
기간이 길어진다.
따라서 특별히 얇게 자른다.
⑺ Lung - 폐에는 공기가 들어 있어 고정이 잘 안되므로주사기로
기관지를 따라 formalin을 주입하여
내부외부고정을 완벽히 한 다음 표본제작
⑻ Appendix .tube(맹장 관상조직) - 횡단면 2개 종단면 1개
⑼ Muscle Nerve(근조지과 신경조직) - 횡단면, 종단면 제작
⑽ Skin - Punch biopsy or incisional biopsy. 표피가 포함 되도
록 잘라야 한다.
⑾ Lyphnode (림프절): 면역장기
① 목적 - 전이여부를 알기위해
- 종양인지의 확인
* incisional biopsy - 종양인지 아닌지를 보기 위해서
아무렇게나 잘라도 됨
* Radical ~tomy -주변의 임파절까지 모두 절치하는 수술
반드시 bisected 한 후 1개만 선정
∴ 임파절이 전이가 잘 되기 때문
⑿ bone - 먼저 고정한 후 bone cutter로 두께 4mm로 잘라내고
탈회 탈회완료후 크기 2X4cm로 잘라
여러 개의 표본을 제작
⒀ Eyeball(안구) - 수정체, 망막, 안신경이 다 포함되도록 자른
후 표본제작
3. Fixation <고정>
: 조직을 물리ㆍ화학적 방법으로 처리하여 이용 조직의 사후 변화를
방지하고 형태ㆍ구조적, 분자적 구성이 생체에서와 같은 상태로
유지되도록 인위적으로 처리하여 관찰에 적합하도록 처리하는 과
정
※ 목적
①Autolysis(자가융해)를 막고 세균에 의한 부폐를 막는다.
(효소, 단백질 기능 불능→세균 사멸)
②가능한한 살아 있는 상태와 유사하게 보존
③구성성분의 유실 방지(경화, 단백응고)
④시약, 약품에 대한 저항성(형태변화 최소화)
⑤매염작용
※ 원리: 세포의 단백질 성분을 물리적 또는 화학적으로 응고 또는
변성시킴으로서 세포구성성분을 불용성으로
변성 시키는 것이다.
1) 고정의 방법
⑴ 화학적 방법
① 가교형(Cross-lingkage)
: 단백질의 아미노기(NH2) + 알데하드기(-CHO)
저분자량 물질의 보존이 우수
- formaldehyde
- glutaraldehyde
- osmium tetroxide
② 응고ㆍ침전형(Precipitation)
: 탈수, 응고(단백질 변성), 고정시 단백뇨는 융해되지 않음.
- Mercuric chloride
- Potassium dichromate
- Chromic acid
- Picric acid
- acetic acid
- ethyl alchol
- acetone
⑵ 고정 방법에 따라
- 침적법: 고정액에 담궈 둔다. (크기가 작은 조직)
- 관류법: 혈관이나 기관지를 통해 주사기로 고정액을 주입
(장기 전체: 폐, 뇌, 췌장, 심장 등)
⑶ 물리적 방법
① 가열
② 동결 - 신속한 진단 또는 특정 물질 검출시
⑷ 고정액의 작용
① 자가융해 방지: 분해효소의 작용을 불활성화, 분해효소의
표적 성분을 화학적으로 변성
② 부패방지: 살균또는 세균의 증식을 억제
③ Hardening(경화작용): 유동적인 원형질을 반고체로 만든다.
표본제작 과정 중 발생하는 조직의 손
상을 방지
④ Mordanting(매염작용): 염색단계에서 염색이 잘 되게 한다.
2) 고정제의 특성
⑴ Formaldehyde
① 냄새 및 자극성이 강한 무색의 기체 (환기 시설이 필요)
② 용해도: 물에 37%-40% →formalin (Concentration
formalin: 37-40%)
③ 장점: 강한 살균력 (방부제로 많이 쓰임)
④ 단점: 단백질을 변성 (교차결합)
- formalin을 장시간 보존할 경우 산소와 결합하여
산화가 되어 formic acid(개미산)을 형성한다.(pH가
낮아진다.)
- Hb와 결합, 흑색의 인공색소(formalin)형성
⑵ Glutaraldehyde
① aldehyde기가 2개가 존재하는 무색의 액체
② 전자 현미경 표준 고정제(농도: 2~3%, pH 7.2~7.5)
③ 갈색병, 냉장보관
⑶ Osmium tetroxide(Osmic acid, OsO4)
① 연한 황색(노란색) 결정체
② 단백질로 탄수화물 및 지질고정에 우수
③ 전자현미경 시료고정의 2차 고정제로 사용
④ 밀폐된 용기에 보관(증발 물질이 인체에 유해, 환기 시설
내에서 사용)
⑤ 불포화 지질을 흑색으로 만드는 가교형성 방식 고정제
⑷ Mercuric chloride (HgCl2, 승홍, 염화 제2수은)
① 백색 결정체 유독성이 강하다.
② 용해도: 물7%,알콜33%
③ 장점- 강력한 단백질 응고력 및 강한 매염작용, 세포질 염색
에 양호
④ 단점- 조직의 침투가 느리고, 조직을 경화 및 위축(단점),
금속 부식성(금속 제품 사용금지)
- 승홍 결정 침착(흑갈색의 인공색소)- 염색 전에 승홍
색소 제거
⑤ 수은 색소 제거법(박절하여 염색전에 제거)
: 수은 색소+Iodine →Mercuric iodine(알콜에 작용)
Iodine색(갈색)+Sodium thiosulfate →무색
⑸ Potassium dichromate(K2Cr2O7, 중크롬산 칼륨)
① 오랜지색 결정체, 음고침전형 고정제
② 조직과 방응하여 불용성의 침전물 형성 가능, 고정 후
반드시 수세(흐르는 물에 12~24시간정도)
⑹ Chromic acid(H2CrO4)
① 갈색(보라색) 결정체
② 응고 침전형 고정제
⑺ Picric acid(2, 4, 6 - trinitrophenol)
① 노란색 결정체
② 용해도: 물(1%), 알콜(5%)
⑻ Acetic acid(CH3COOH, 초산)
① 무색의 액체
② 교원 섬유 이완 효과
⑼ Ethyl alcohol(C2H5OH)
① 무색 투명한 휘발성 액체
② 장점- 당원 핵산효소 증명에 우수
③ 단점- 강력한 탈수작용(단백질 응고), 조직의 위축
⑽ Acetone(CH3COCH3)
① 무색 액체, 휘발성, 인화성
② 조직내 효소 증명에 이용
3)고정제의 종류
⑴ Formalin계 고정액
① 10% formalin sol
ⅰ. 가장많이 사용
ⅱ. 제조가 간단하고 가격이 저렴하다.
ⅲ. 적정 pH 7.0 (고정효과최대)
ⅳ. 장시간 방치시 pH가 내려간다.
- pH 5.6 이하시 포르말린 색소를 형성하는데 이 색소는
조직내 적혈구가 파괴되어 갈색의
포르말린 색소가 형성하는 것인데, 이 pH를 중화하기
위해 중화제(Calcium Carbonate,
Magnesium Carbonate)를 사용할 수 있다.
ⅴ. 지방 고정에 우수하며, 살균력, 침투력이 좋다.
ⅵ. formalin에 의한 고정이 염기성 염료와 조직의 조직화학
적 성분과의 친화력을 증가 시키는 이유는
조직의 amino기와 결합하기 때문이다.
ⅶ. Formalin conc 10ml + D/W 90ml
② 10% Neutral buffer formalin(10% NBF)
- 증류수 대신 완충액(인산)을 첨가하여 pH를 조절한다.
⑵ Picric acid계 고정액
① Boin sol
ⅰ. picric acid + formalin conc + acetic acid(G.A.A)
ⅱ. Masson's trichrome 염색시 매염제로 사용(56℃/1시간)
ⅲ. 골수(Bone marrow) 조직 고정, 탈회에 사용
② D.B(Duboscg-brasil)
ⅰ. 신장(Kidney)조직을 고정시 사용
ⅱ. 조직이 노랗게 착색됨으로 흐르는물에10분정도수세한다.
③ Rossman
④ Gendre
⑶ Mercuric chloride계 고정액
① Zenker's sol
ⅰ. Mercuric chloride + Pot. dichromate + Sod. sulfate + D.W
ⅱ. 사용직전에 G.A.A(빙초산)첨가
ⅲ. 조혈장기에 우수, 결합조직, 교정시간 유의 (너무 길지 않게)
ⅳ. PTHA 염색시 매염제로 사용
ⅴ. 수은 색소 제거하여 사용
② helly's sol
ⅰ. Zenker's sol + Formalin conc
ⅱ. 수은 색소 제거하여 사용
③ heiden-keins susa sol
ⅰ. 수은 색소 제거하여 사용
④ Maximow sol
ⅰ. 수은 색소 제거하여 사용
⑤ Schaudinn sol
ⅰ. 수은 색소 제거하여 사용
⑥ B-5 sol - 악성 림프종 진단 목적으로 림프절 고정에 사용
⑷ Pot. dichromate계 고정액
① Muller sol
ⅰ. 크롬 친화성 조직 증명(부신 수질 세포: 크로마틴 과립
(세포질내))
ⅱ. 12-24시간(조정후 수세)
② Regaud(Moller) sol
③ Orth sol
⑸ Osmium tetroxide(Osmic acid, OsO4)계 고정액
① Flemming sol
ⅰ. 유색
ⅱ고정후 수세
ⅱ. 2%OsO4 + Chromium trioxide + Acetic acid
② Champy sol
ⅰ. Flemming sol - acetic acid + pot.dichromate
⑹ 기타 고정액
① Carnoy sol
ⅰ. Absolute alcohol + Chloroform + G.A.A
ⅱ. glycogen, 핵산 Nissle body 고정에 우수
ⅲ. 단점은 심한조직의 위축을 초래한다.
ⅳ. 고정시간에 유의해야 한다.(3-4시간 이내, 신속 표
본 제작시)
ⅴ. 물이 포함되지 않은 고정액, 수세가 불필요한 고정액
② Kaiserling sol
ⅰ. 3단계로 나눠져 있다.
ⅱ. 전시 목적 고정(본래의 색 유지)
전자현미경 시료 고정액
☆ Glutaraldehyde - 1차 고정액 (전 고정)
☆ Osmium tetroxide - 2ck 고정액 (후 고정)
1. 박물용 고정액 과정
: 장기를 장시간 보존하면서 전시 교육용으로 사용할 때
① Kaiserling sol I: 1-5일 일반적인 고정
② Kaiserling sol II: 1-6일간 색 복원
③ Kaiserling sol III: 영구 보존
2. 고정
⑴ 즉시 고정 원칙
① 떼어낸 즉시 고정액에 넣는 것이 원칙
② 부득이한 경우 냉장고 보관
③ (일시적) 생리식염수 거즈를 덮는다.
⑵ 고정용기
① 입구가 큰 용기 사용
② 미소조직- 투명한 용기 사용
⑶ 고정액량 : 조직용적의 10-20배
⑷ 고정액의 침투율
① 약 1mm/hr
② Pot. dichromate 1.33mm/hr로 빠르다.
⑸ 온도
① 일반고정: 실온
② 전자 현미경 고정: 0 - 4℃
③ 조직 화학적 고정: 0 - 4℃
④ 응급 신족 고정: 동결 또는 점진적 가열
⑹ pH
① 인체의 pH와 흡사하도록 한다.
② 전자 현미경 고정시 완충액 사용해서 pH 고정
4. 탈회(decalcification)
: 뼈조직, 치아 석화화된 조직 (결핵 병소)등 고정 완료 후 조직
과정 단계를 거치기 전에 Calcium 성분을
제거하여 조직을 연화 => 탈회
< 탈회 원리>
1. 산(acid) 용액에 의한 탈회법
⑴ 원리: 산(acid) 용액은 칼슘 염에 작용해서 칼슘이온을 해리(유
리) 시키며 유리된 칼슘이온은 음이온과 결합하여 용해성
칼슘염을 형성 (Capo4, CaCo3 - 불용성 칼슘염)
⑵ 무기산 이용: 염산, 초산, 질산, 황산, formic acid, Nitric
acid 등
- 산성용액의 종류
① Nitric acid 5-7% 수용액
저농도 → 조직의 팽창
고농도 → 염색성 저하
질산 수용액은 장시간 방치하면 아질산으로 변성될
수가 있다.(탈회능 및 염색성 저하)
* 사용할 때 반드시 탈회액을 매일 신선한 것으로 교환해
주어야 함
② HCl
③ TCA 용액 - 5-10% 수용액
- 탈회속도 및 염색성 우수 조직 손상이 심하다.
④ Formic acid - 탈회능이 약하다.
- 조직 손상이 적다.
2. 완충액 또는 킬레이트에 의한 탈회법
※ Chelating agent-EDTA(금속이온과 결합할 수 있는 유기화합물)
① 조직에 대한 상해가 적고 구조 및 염색성 보존이 우수
② 탈회속도가 느리다.
③ 조직 화학 검사에 이용 (조직내 효소 또는 기타 화학 성분
검출시)
④ Gr. 게의 집게발 의미
3. 이온 교환 수지 탈회법
① ion-exchange-resin: 수지 표면의 이온이 다른 이온과 치환되
는 성질을 이용 즉 유리된 칼슘이온을 수
지로 흡수 치환되면서 제거
② 탈회액: 10% formic acid 80ml
③ Ion exchange resin
4. 전기분해 탈회법 (신속하게 탈회 할 수 있다.)
① 준비물: 유리 그릇, 탄소봉, 백금선(+) 전극(직류), 전해질
용액(탈회액, Formic acid), Conc HCl, D.W
② 탈회시 온도: 30-45℃
<탈회 과정>
1). 탈회조직의 절취: 전기톱 이용 (조직이 파괴되지 않도록)
2). 고정: 조직의 손상을 막기위해 반드시 탈회전 고정
3). 탈회: 탈회할 조직을 탈회용액에 담근다.(조직을 실에 묶어 용기
에 매달아 둔다.)
☆ 매일 새 용액으로 갈아준다.
4). 탈회촉진: 가온, 교반 (진탕), 현수
5). 탈회 완료 시점의 결정
6). 완료시점의 파악
① 물리적 방법 - Pin, 칼로 배거나 찔러본다.
② 화학적 방법 - 시험관내에서 탈회액에 5% Sod. Ammonium
oxalate
첨가하여 혼탁여부를 알아본다.
☆ 혼탁시- 칼슘이 남아있다.
7). 중화
① 5% Sod. sulfate
② 5% Lithium Carbonate
8). 7% alcohol
9). 수세
5. Tissue capsuling (조직 교갑)
① 고정이 완료된 조직과 탈회가 완료된 조직은 각각의 인식
라벨이 늘 같이 존재해야 한다.
② 조직을 안전하게 보호하는 tissue capsule에 넣어 조직표본
제작 과정을 거치게 된다.
③ Tissue tek의 Cassette는 상부에 연필로 적도록 되어있고
이 cassette에 그대로 포매하게 되어있다.
④ 인식 라벨을 연필로 적는다.
6. washing(수세)
① 고정액을 제거하기 위해서 흐르는 물로 수세한다.
(조잭내 산 또는 알카리 성분 제거)
② 흐르는 물에 하루밤 처리(탈수 과정부터 재개)
③ 조직의 유실 및 번호표 유실을 주의
7. Dehydration(탈수)
① 확산작용에 의해 물을 밀어냄 (탈수원리)
② 물과 잘 섞이는 물질로 조직내의 수분을 점진적으로 대치하는
과정
③ paraffin은 수세한 후 조직 내부에 남아있는 수분과 혼합되지
않으므로 이를 제거
⑴ 종류
① ethyl alcohol(ethanol)
② isoprophyl alcohol(isoprophanol)
③ amyl alcohol(pentanol)
④ acetone(도특한 자극성 냄새 휘발성 강함)
⑤ ethylene glycol(cellosolve)
⑥ tetrohydrofuran
⑦ buthyl alcohol(buthanol): 투명과정을 거치지 않아도 된다.
(투명과 침투과정을 동시에 거친다.)
⑧ Dioxine: 투명과정을 거치지 않아도 된다.
(투명과 침투과정을 동시에 거친다.)
⑵ 탈수과정
① 저농도 알콜 ⇒ 고농도 알콜(80%알콜⇒100%알콜, 7~8단계)
② 이유: 농도차에 의한 급격한 확산으로 인한 조직의 손상을 방
지 (단백이 응고되는 알콜농도-70%)
③ 가장 이상적인 탈수란: 동적 평형상태가 될 때(물과알콜간의
동적 평형상태)
④ 탈수 완료 단계: 조직에 비결합수가 약 3-4% 수분이 포함 상태
⑶ 무수알콜 제조법
① 무수 황상동(CuSO4) ⇒ 회백색 흡수성이 강하다.
② 물이 희석된 알콜 + CuSO4 ⇒ 무수알콜 + 청색 황산동
③ 청색 황산동 ⇒ 연한 황산동 ⇒ 회백색 황산동
100℃ 200℃
8. Cleaning (투명)
: 탈수제와 파라핀 모두에 잘 섞이는 물질로 탈수제를 대치시키
는 과정
⑴ 투명제란: Alcohol 탈수 과정을 거친 조직에서 alcohol을 제거하
여 주며 침투제인 Paraffin과 잘 혼합될 수 있는 물질
⑵ 투명제의 조건
① Alcohol 제거능력이 신속해야 한다.
② 조직을 너무 경화시켜 서는 안된다.
③ 독성이 적을수록 좋다.
④ 가연성이 낮을수록 좋다.
⑤ 가격이 저렴해야 한다.
⑶ 투명제의 종류
① Xylene - 투명제로 검사실에서 널리 이용된다.
- 투명을 잘 하게 위해서는 조직 두께가 3-4mm 초과하
지 말아야 하며, 이 경우 1시간 정도로
2-3단계를 거쳐야 한다.
- 이 용액은 alcohol을 제거하는 작용이 매우 빠른 우수
한 투명제 값도 저렴 paraffin 제거
및 용해 기능도 좋다.
- 단 조직을 오래 담궈둘 경우 조직이 경화되어 박절하
기가 어렵다.
- Xylene의 증기는 유독 하므로 환기를 잘 하거나 fume
fool로 제거하여야 한다.
② Toluene
③ Benzene
④ Chloroform
⑤ Cerdar wood oil
⑥ carbon tetrachloride
⑦ aniline oil
⑧ histoclear
⑨ pyridine
⑷ 조직을 처리하는 시간
① 2단계, 1시간~1시간30분(3시간)
② 장시간 처리시 조직이 단단해 진다.
⑸ 물+알콜+Xylene ⇒ 혼탁(우유색): 탈수 과정이 충분해야 한다.
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