9. Inpregnation or Infilteration 침투
: 부드러운 조직에 침투제를 채워 조직에 적당한 강도를 부여하
는 단계
⑴ 침투제의 종류
① 비수용성 침투제: paraffin, Celloidin, Plastic(Epon)
② 수용성 침투제: Carbo-wax, Gelatine, Agar, Gums
⑵paraffin
① Paraffin은 methan 계열의 탄화수소 화합물로 그 융점에 따라
여러등급의 질로 나누어 진다.
② 연질 paraffin 융점 45-50%: 연구용 특수 목적
③ 경질 paraffin 융점 56-58%: 일반조직 검사용
④ paraffin의 융점이 높은 것이 낮은 것보다 실온에서 더 단단히
굳어 박절시 얇고 균일한 ribbon을 만들어 낸다.
⑤ paraffin oven, paraffin dispenser내부온도: 60-62% 항상 유지
⑥ cooling 장점: Liquid ⇔ Solid
heating
조직 속으로 잘 침투한다.
⑶ 침투과정: paraffin wax의 침투과정은 조직 내에 투명제가 완전히
제거되고, 조직에 충분히 침투해야 하며
60℃의 paraffin oven에서 paraffin both를 2, 3번 단계적
으로 1시간식 경과하면 충분하고
3단계에서 시간을 연장하는 방법이 가장 무난
⑷ Paraffin 침투방법
① 수동 침투법
② 자동 침투법
- 처리과정: 탈수 →투명 →침투
- 종류: 개방형, 폐쇄형
- 12단계로 구성: 1~8번(탈수, 알콜), 9~10번(투명, Xylene),
11~12번(침투, paraffin bath)
- 소요시간: 14~15시간
③ 진공 침투법: 폐조직과 같이 공기가 함유되어 paraffin 침투가
어렵거나 Skin, blood clot, spleen,
bone과 같이 단단한 결체조직에 적용하면 좋다.
◎ Autotechnicon의 기본구조
⑴ beeker 이동 회전축
⑵ Beeaker 12단계
① 고정액: 1단계
② water: 1단계
③ 탈수과정: 6단계
④ 투명과정: 2단계 (Xylene 1,2)
⑤ 침투과정: 2단계 (paraffin 1,2)
⑶ Timing disk
⑷ Delay timer: weekend
⑸ 진탕 장치
⑹ 가온 장치
☆ 기계사용시 주의점
① 용액 양의 확인 (특히 밀폐형)
② Timer 확인
③ Paraffin beaker 확인
10. Embedding 포매
: 특수한 매질을 조직에 침투시켜 조직을 일정한 경도로
(박절에 적합한 형태로) 단단하게
경화시키는(준비시키는) 과정
⑴ 경화방법
① 동결: -20℃이하
② 지지 물질을 조직내 침투
⑵ 경화원리
① 결정화(Crystalization)
ⅰ. 원리: 고온(액체) →저온(고체)
ⅱ. paraffin, Carbo wax gelatin 등
ⅲ. 융점(mwlting point)이 60℃전후
ⅳ. 단점: 조직을 60℃정도의 고온 처리
② 용액 휘발(Evaporation of solvent)
ⅰ. 원리: 묽은 용액 상태로 침투 →용매 휘발
ⅱ. celloidin(Nitrocellulose)
ⅲ. 장점: 실온 침투 가능
ⅳ. 단점: 시간이 많이 소요(4주)
③ 중합법(Polymerization)
ⅰ. 원리: 도량체(monomer) ⇒ 중합체(polymer)
중합개시제 첨가
⑶ 포매방법
① 포매 mold에 녹은 paraffin을 붓는다.
② paraffin이 굳기 전에 병변 부위를 하향하여 조심스럽게 안착
시킨다.
③ 기포의 형성유무를 살피고 조직은 전면이 바닥에 잘 밀착되었
나 확인한다.
④ paraffin 표면에 얇은 막이 형성될 때 환자 label을 붙인다.
⑤ 냉소에서 균등하게 냉각시켜 굳힌다.
⑷ 포매시 조직의 방향 설정법
① 일반조직 - 넓은 부위가 하향
② 난관 맹장등 관상조직 - 횡단면과 종단면의 하향
③ Skin- 표피 진피가 다 나오도록 심는다.
④ 장관조직(위,소장등)- 점막층, 점막하층, 근층 장막층이 다
나오도록 세워서 심는다.
⑤ 림프절 - 절반을 잘라서 넣는다.
⑥ 근육,신경조직 - 횡단면, 종단면으로 여러조각 나누어서 심는
다.
⑦ 수술경계부위 - 먹물로 표시
⑧ 방향 설정이 중요할 경우에는 먹물로 표시
⑨ 침생검 조직의 경우 - 크고 작은 순서를 반복 or 길이 순으로
포매
⑸ 포매 몰드의 종류
① 'ㄱ'자 철제(2개) - 상자크기를 조절할 수 있다. 작업 속도는
느리다.
② Mansonite tray
③ Base mold - embedding ring tissue Cassete 이용
⑹ 포매시 이용되는 기구
① 포매기(embedding center) ② Base mold, Plastic ring
③ "ㄱ" 자형 철재 ④ 핀셋
⑺ 파라핀 포매의 장,단점
① 장점 - 얇은 박절
- 과정이 신속
- 연속 절편 (Ribbon 형성)
- 블록 보관이 용이 - 장기간 보존
- 경제적
② 단점 - 고온의 파라핀 ( 조직의 경화 및 뒤틀림 )
- 일부조직은 침투가 어렵다.
- 대형절편 불가
⑻ 포매 센터의 구조와 사용법
① Embedding center: 포매는 집중적으로 작업할 수 있게 설비된
기계
② Paraffin 용해통 및 분주 장치
③ Cryo-plate: 포매된 블록을 굳히는 냉각판
④ warm -plate: 포매할 때 조직과 paraffin이 굳지 않고 녹은
상태로 유지해 주는 온판
⑤ forcep warmer: forcep 끝에 묻은 파라핀이 냉각되어 굳으면
세밀한 작은 조직의 포매에 방해되므로
항상 녹은 상태로 가온이 된다.
⑼ Paraffin warming chamber: 침투과정이 끝난 조직을 포매 전까지
보관하는 곳
⑽ 포매 Center에 의한 포매방법
① paraffin 침투 과정까지 완전히 끝난 조직을 paraffin warming
chamber에 넣는다.
② hot plate의 온도를 60℃정도로 올리고, Cryo- plate의 switch
를 on해 차게 해 놓는다.
③ 가온된 forsep으로 tissue capsule을 꺼내고 조직의 크기를
보아 base mold의 크기를 결정한다.
④ Base mold에 파라핀 채운다.
⑤ 방향을 잘 잡아 조직을 base mold에 안착시킨다.
⑥ Plastic Embedding ring
⑦ Embedding ring에 paraffin을 추가해서 채우고 환자의 인식
label을 붙인다.
⑧ cryo- plate에 올려 놓는다.
⑨ 완전히 굳으면 base mold 때어내고 paraffin block은 얼음판
위에 올려놓고 박절 준비한다.
⑾ 포매의 일반 사항
① 포매전 투명제는 paraffin으로 대체한다.
② paraffin 침투를 너무 오래해도 조직의 위축과 경화가 온다.
③ paraffin 침투시간은 조직의 두께와 조직의 성분에 달려있다.
④ Brain, spinal cord, Skin등은 하루밤 방치해서 침투시킨다.
⑤ Embrdding center나 paraffin oven의 온도를 항상 60℃인가
점검한다.
⑥ 병소 부위가 하향되도록 한다.
11. Trimming 삭정
: 삭정이란 block을 박절하기 위해 다듬고 대목에 부착시키는
과정, 요즘은 대목용도인 embedding ring 이나 embrdding
Cassette를 쓰기 때문에 거의 삭정하지 않는다.
12. Microtome cutting 박절
⑴ Microtome의 종류
① biconcave형
② planocave형
③ plano wedge형
④ tool-edge형
⑤ Disposable knife형: 사용도중 칼날이 무디어진 즉시 교환해
사용할 수 있으므로 항상 예리한 칼날을 유지
⑵ 마도후 칼의 검사 - 갈검사대 위에 칼을 얹고 현미경으로 관찰
(X100)
⑶ 박절기(Microtome)
① 회전형 박절기 (rotary microtome): 칼이 고정 블록이 이동,
두께 조절기, 미동손잡이, 자동손잡이
② 활주형 박절기 (Sliding microtome)- 블록이 고정, 칼이 이동
⑷ 박절의 원리와 칼의 고착 요령
① 틈의각(clearance angle): 블록의 표면과 칼날의 절단선 사이에
형성되는 각도, 5-10%가 적당하며 7도가 이상적
② 칼을 당기는 각(knife pull slope angle) 활주로의 축과 block
방향에 대한 각도 동결절편과 rotary microtome의 칼의 당기는
각은 90도로 paraffin 박절의 경우는 45도로 celloidin 박절의
경우는 35도로 맞추는 것이 이상적이다.
⑸ 칼 자체의 마도면의 각(facet or bevel angle): 칼 끝의 양면인
마도면과 마도면의 각으로 잘 연마된
칼의 쐐기의 각 (Wedge angle)은15도이다.
⑹ 박절시 필요한 기구
① 부유 온수조(Water bath)
ⅰ. 박절된 절편의 주름을 펴는데 사용(전에 50%alcohol 사용)
ⅱ. Paraffin이 녹지 않으면서 주름이 잘 펴지게 45-50℃로 맞
춘다.
ⅲ. 부유된 절편이 잘 보이도록 바닥이 검정색으로 되어 있다.
ⅳ. 접착제 처리를 해 준다.
<부착제 사용 방법>
- 부유 온수조에 용해: gelatin 1%
- 슬라이딩 코팅: egg albumin
② 신전기(Slide warmer)
ⅰ. 60℃ 온도를 유지하는 평평한 판
ⅱ. paeaffin의 융점보다 약간 높게 사용(paraffin보다 2~3℃
높게), paraffin oven 30분~1시간
ⅲ. 절편을 슬라이드에 단단히 접착의 목적, 최소 30분간 처리
한다.
☆ Slide 부착제 (adhesive)
: 탈외된 뇌조직등 접착력이 약한 조직들을 염색과정중에 탈
락하기 쉬우므로 부착제를 사용
☆ mayer's egg albumin
- egg white 50ml
- glycerin 50ml
를 여과한다. 방부제로 thymol 결정 한 개를 넣고 냉장 보관
Slide 제작은 Slide glass에 Mayer's egg albumin을 한 방울
얹고 깨끗한 gauze 로 전면에 고루 바른다. (아주 얇게 칠한다.)
⑺ 동결절편 (Frozen section)
① 목적
- 수술 중 신속한 표본 제작(진단을 위해 ,악성유무)
- 지방이나 효소와 같은 특정물질 검출시(60℃이상에서 효소가
불활성화 되기 때문)
- 면역 조직화학적 검사 - 파라핀 절편은 항원이 소실될 우려
가 있으므로
② CO2 동결박절법(satorius type)
- 열의 전도에 의한 동결: 조직을 냉매에 직접 접촉, 냉매의 종
류 (액화질소, 드라이아이스)
- 기화열을 이용하는 방법
③ Cryostat(전기식 동결절편기)
전기를 이용해 -30℃까지 조직을 동결시킬 수 있으며 냉동 캐비
넷 안에 rotary microtome 이 45도 경사로 장착 전기식 동결절
편기를 사용할 때는 고정되지 않은 fresh 한 조직사용
④ 동결시 온도
- 표준 내부 온도: -20℃
- 지질: -30℃
※ 조직에 따라 동결 온도가 달라질 수 있다.
⑤ OCT compound
동결 절편에 사용되는 수용성 포매제
13. Stain 염색
⑴ 염료의 분류
① 천연염료 (Natural dyes): 식물, 열매,곤충 등에서 추출한 염료
ⅰ. hematoxylin: 주로 핵염색에 사용
ⅱ. indigo
ⅲ. carmine: 성염색체, 당원염색, 점액염색
ⅳ. Orcein: 탄력섬유의 증명과 B형 간염의 항원 봉입체를 증명
ⅴ. saffron
ⅵ. Litmus
② 인공 합성염료(Synthetic dyes)
염료 구조 = Benzene + 발색단 + 조색단
③ 산성염료와 염기성 염료
㉠ Acidic dye (음이온성 염료)
ⅰ. 발색단이 염료 분자의 (-)음이온 쪽에 위치
ⅱ.조직내에(+)로 하전성분에 결합(세포질,교원섬유 등)
ⅲ.Na(양이온,salt 상태로 판매, chromogen + Auxochrome) ⇒
수용액에서는 음이온으로 대전
ⅳ. 원자기 COOH, OH, SO3H 일반적 성질은 alcohol에 잘 녹지
않고 물에 잘 녹는다.
㉡ Basic dye (양이온성 염료)
ⅰ. 발색단이 염료분자의 (+)양이온 쪽에 위치
ⅱ. 주로(-)로 하전된 부위에 결합(핵산(DNA, RNA,핵)
ⅲ. Cl(음이온,chromogen+Auxochrome)⇒alcohol에 잘녹는다.
⑵ 염색의 적용
: 염색은 생조직이나 고정된 조직의 다양한 조직 성분과 세포구성
성분을 착색시켜 이를 잘 구별하려는 목적으로 시행
① 생체내 염색
- 생체내 염색 살아있는 동물 체내에 직접염료를 주입
- 사용하는 염료: 실험 동물에 무해한 염료(Trypan blue)
- 목적: 탐식 세포 계통 연구
② Supervital stain(초생체 염색)
- 떼어낸 살아있는 세포를 염색
- 사용염료
: Janus green(미토콘드리아 염색), Neutra red(용해소체 염
색), Methylene blue(신경섬유 염색)
③ 진행성 염색 (progressive stainning)
: 현미경하에서 염색을 진행시키다가 조직내의 원하는 부분과
그외의 부분이 구분이 될 때 염색중단
ex) Mayer's hematoxylin 핵염색
④ 퇴행성 염색 (regressive stainning)
: 전체조직을 염색한 다음 원하지 않는 부분에 과염된 염료를
감별과정을 거쳐 제거한다.
ex)Gram stain Harris hematoxyl 핵염색
* Differention 감별: 고정된 염료를 제거하는 방법 감별제
① 산성용액 염기성 용액
② 고농도의 매염제
③ 완충액 (pH 6.0~6.5)
wright stain 할 때 Eosin pH6.5에서 탈색 Methylene pH6.0
에서 탈색
④ 산화제: pot.permangnate, ferricyanide, bisulfite
⑶ 염색반응
① 물리적인 면
ⅰ. 용해성 반응: 염료의 분산도 및 조직 구성 밀도
ex)지방염색 - sudan dye
ⅱ. 흡착성 반응: 거치른 구조의 조직: 큰 입자의 염료
조밀한 구조의 조직: 작은 입자의
② 화학적인 면
ⅰ. 염기성 염료(+): (-)음으로 하전된 조직(DNA, RNA, 인지
질, 비만세포, 연골, 일부 점액 등)
ⅱ. 산성 염료(-): (+)양으로 하전된 조직(교원섬유, 호산구
과립, 세포질)
③ 염색반응에 영향을 주는 요인
ⅰ. 염색액의 이온 강도
ⅱ. 염색액의 농도
ⅲ. 고정농도
ⅳ. 온도
⑷ 일반염색 (Routine staining) H&E stain
① Hematoxylin ⇒ Hematein
자연산화(O2)
인공산화(Mercuric oxide, sod. Iodate, Ferric
chloride)
Hematein(염료) + 매염제 ⇒ Hematein-lake
매염제(Amm or pot alum,
Ferric chloride,
Phosphotungstic acid)
※ 매염제에 따른 Hematoxylin의 분류
⑴ Alum. hematoxylin - 핵염색액
① Harris hematoxylin 용액 (퇴행성 염색)
A용액 - hematoxylin crystal 5g
- 무수 alcohol 50ml
B용액 - ammnium 또는 pot. alum 100g
증류수 1000ml
C용액 - Mercuric oxide red(산화제) 2.5g
Mercuric oxide를 한번에 다 넣는 것은 급격한 산화를 유발하여
용액이 튀어나와 위험하다.
(검은 자주색으로 변함) 다시 한번 더 끓인 다음 찬 물에
신속히 냉각 핵 염색에 사용할 때
용액 250ml당 G.A.A를 10방울 정도 가해주면 핵 염색이 증진
② Mayer's hematoxylin 용액 (진행성 염색)
③ Ehrlich hematoxylin 용액
④ Delafield hematoxylin 용액
⑵ Iron hematoxylin
① weight iron hematoxylin 용액: 특수 염색시 핵 염색
② heiden hain's hematoxylin 용액: 원충류 세포봉입
체, Myerlin sheath
⑶ Tungsten hematoxylin
① Phosphotungstic acid hematoxylin(PTAH): 횡문근 염색
② 세포질 염색액: 핵 이외 물질 염색(세포질, 근육 결합조직)
ⅰ. 산성염료 eosin Y (pinkish-red) 특이성이 낮다.
ⅱ. 2% Eosin 수용액
Eosin Y 수용액 ----5g
증류수 ----------250ml
G.A.A -----------0.5ml
⑸ 염색의 일반적 과정
탈파라핀 →함수 →수세 →염색(Harri's Hematoxylin: 핵염색) →
수세 →분별 →수세 → 중화 →수세(청색화) →Eosin(핵 이외의 세
포질 염색) →탈수 →투명 →봉입
① 탈 파라핀 과정
: 조직 내에 침투한 파라핀과 조직 외부에 포매 된 paraffin을
제거하는 과정, Xylene이 주로 쓰인다.
② 함수(hydration)
: 고농도의 alcohol에서 저농도의 alcohol을 단계적으로 거친
다음 증류수로 수세
목적: 염색액이 대부분 수용액 상태이기 때문에 ex) 100%--->
100%--->95%--->95%--->80%--->70%
③ 염색(퇴행성)
- Hrris hematoxylin (5-6분)
- 수세 (흐르는물)
- 0.5-1% HCl in 75% alcohool(5-10 dips): 감별제
- 수세
- Amm. water (0.3%): 3 - 5dips "청색화 " (blueing)
- 수세
- eosin 2-3분(세포질 염색)
④ 탈수 투명 과정
ⅰ. 탈수: 95%⇒95%⇒100%⇒100% (저농도⇒고농도)
ⅱ. 투명 Xylene
: 불완전한 탈수의 원인은 대개 탈수용액을 거치는 시간이
짧을 때, 탈수용액에 물이 오염되었을 때
14. Mounting (봉입)
: 염색이 완료된 조직 표본에 봉입제를 묻힌 cover glass 씌우
는 일
⑴ 봉입제의 종류
① 수용성 봉입제: 지방염색, 변색성 염색, 면역 형광염색, 면역효
소염색, 조직 효소염색에 사용
ⅰ. Glycerin
ⅱ. Glycerin-jelly
ⅲ. 물
ⅳ. Apathy gum syrup
ⅴ. Crystal mount
② 비수용성 봉입제
ⅰ. canada balsam (Xylene으로 동？U혼합해서 사용, 천연수지)
ⅱ. Permount
ⅲ. HSR(Histoclard)
ⅳ. Enkitt
ⅴ. Ceder wood oil(immersion oil)
⑵ 봉입의 목적
① 절편의 손상 방지
② 부패(습기, 세균) 방지
③ 퇴색방지
⑶ 봉입제의 조건
① 접착성
② 무색, 투명
③ 굴절율(RI)이 조직의 평균 굴절률(1.530~1.540)과 비슷한 것
④ 염색 결과에 영향을 주지 않는 것
< Special stain >
※ 목적: 일반염색으로는 감별할 수 없는 특정물질을 관찰하기 위해
특수 염색을 한다. 일차적 H&E stain을 한다. 이차적으로
H&E stain으로 불가능한 성분을 염색한다.
1. Collagen fiber(아교섬유)염색
⑴ 의의: ①근섬유와의 구별 ② 간경변증 심장질환등 섬유화증
③ 종양세포의 발생학적 기원을 분별
⑵ Van Gieson's fushin-picric acid Stain
① 원리: 강산성 용액상태에서 교원섬유가 산성용액을 선택적으로
흡착함을 이용. (두가지 산성 염료가 혼합된 염색액에서
아교섬유와 근섬유가 선택적으로 착색)
② 주시약: Weight iron hematoxylin(핵: 청색)
Van Gieson solution = picrofuchin (yellow)
- saturated picric acid(포화수용액)
- 1% acid fuchsin
- Hcl
③ 방법: ⅰ. 탈 paraffin , 함수, 수세
ⅱ. weight iron hematoxylin - 10분 염색
ⅲ. 유수에 수세 (핵을 청색) - 10분
ⅳ. Van Gieson solution에 염색 - 5분
ⅴ. 수세 없이 바로 탈수, 투명, 봉입
④ 결과: Collagen fiber ⇒ red
Muscle, Cytoplasm ⇒ yellow
Nuclei ⇒ Blush black
⑶ Masson's trichrome stain
① 원리
ⅰ. 전체를 산성염료 염색(Acid fuchsin+Beibrich scarlet)
ⅱ. Phosphotungstic acid+Phosphomolybdic acid(아교섬유에만
선택적 결합, (-)전하)
ⅲ. Aniline blue(청색염료)반응(아교섬유만 청색 염색)
② 주시약
ⅰ. 고정제로 Bouin용액을 사용한다.
ⅱ. Weight iron hematoxylin(blue): 핵염색
ⅲ. Biebrich scalet-acid fucshin(red): 교원섬유와 근섬유를
염색
ⅳ. Phosphmolybdic-phosphotungstic acid
: 교원섬유에서 Biebrich scalet이 밀려나고(탈색) 금속염
이 교원섬유에 결합되어 (-)전하를 제공하게 된다.
ⅴ Anilin blue(산성pH에서 (+)로 하전) 교원섬유는(청색)으로
된다.
③ 방법
ⅰ. 탈파라핀, 함수 수세
ⅱ. 매염(Bouin용액, Picricacid): 56℃ 1시간
ⅲ. 색소(노란색) 제거: 흐르는 물에 10분
ⅳ. 핵염색(Weigert Iron hematoxylin)
ⅴ. 수도수에 10분(흑청색 형성)
ⅵ. 본염색(Acid fuchsin-Beibrich scarlet): 전체 적색
ⅶ. 분별(PTH+PMA): 아교섬유(-)전하
ⅷ. 아교섬유염색(Aniline blue): 청색
ⅸ. 수세없이 바로 탈수, 투명, 봉입
④ 결과: Collagen fiber - blue
Muscle, Cytoplasm - Red
Neuclei - Blushi black
☆ 접착제로 egg albumin을 쓴다.
⑷ PTAH stain(Phosphotungstic acid hematoxin)
① 원리
ⅰ. 염료+매염제(lake) →핵, 근육세포(청색)
ⅱ. Tungstein ion →아교섬유(오렌지색)
② 주시약: Hematoxylin 1g
PTA 20g
D.W
③ 방법
ⅰ. 탈파라핀, 함수, 수세
ⅱ. 매염과정(Zenker용액)
ⅲ. Mercuric chloride
ⅳ. Iodine, Sod.thiosulfate
ⅴ. 본염색(PTAH 용액): 56℃ 1시간(90분)
ⅵ. 탈수, 투명, 봉입
④ 결과: 근섬유 - 청색, 아교섬유 - 오렌지색, 핵 - 청색
☆ PTAH 용액의 조성: 1:20의 비율
☆ 산화제: 자연산화(O2), 인위적 산화(Pot. permanganate)
☆ 횡문을 잘 볼 수 있는 염색법이다.
☆ 신경조직의 별아교세포(Astrocyte)를 증명할 수 있다.
: 부드러운 조직에 침투제를 채워 조직에 적당한 강도를 부여하
는 단계
⑴ 침투제의 종류
① 비수용성 침투제: paraffin, Celloidin, Plastic(Epon)
② 수용성 침투제: Carbo-wax, Gelatine, Agar, Gums
⑵paraffin
① Paraffin은 methan 계열의 탄화수소 화합물로 그 융점에 따라
여러등급의 질로 나누어 진다.
② 연질 paraffin 융점 45-50%: 연구용 특수 목적
③ 경질 paraffin 융점 56-58%: 일반조직 검사용
④ paraffin의 융점이 높은 것이 낮은 것보다 실온에서 더 단단히
굳어 박절시 얇고 균일한 ribbon을 만들어 낸다.
⑤ paraffin oven, paraffin dispenser내부온도: 60-62% 항상 유지
⑥ cooling 장점: Liquid ⇔ Solid
heating
조직 속으로 잘 침투한다.
⑶ 침투과정: paraffin wax의 침투과정은 조직 내에 투명제가 완전히
제거되고, 조직에 충분히 침투해야 하며
60℃의 paraffin oven에서 paraffin both를 2, 3번 단계적
으로 1시간식 경과하면 충분하고
3단계에서 시간을 연장하는 방법이 가장 무난
⑷ Paraffin 침투방법
① 수동 침투법
② 자동 침투법
- 처리과정: 탈수 →투명 →침투
- 종류: 개방형, 폐쇄형
- 12단계로 구성: 1~8번(탈수, 알콜), 9~10번(투명, Xylene),
11~12번(침투, paraffin bath)
- 소요시간: 14~15시간
③ 진공 침투법: 폐조직과 같이 공기가 함유되어 paraffin 침투가
어렵거나 Skin, blood clot, spleen,
bone과 같이 단단한 결체조직에 적용하면 좋다.
◎ Autotechnicon의 기본구조
⑴ beeker 이동 회전축
⑵ Beeaker 12단계
① 고정액: 1단계
② water: 1단계
③ 탈수과정: 6단계
④ 투명과정: 2단계 (Xylene 1,2)
⑤ 침투과정: 2단계 (paraffin 1,2)
⑶ Timing disk
⑷ Delay timer: weekend
⑸ 진탕 장치
⑹ 가온 장치
☆ 기계사용시 주의점
① 용액 양의 확인 (특히 밀폐형)
② Timer 확인
③ Paraffin beaker 확인
10. Embedding 포매
: 특수한 매질을 조직에 침투시켜 조직을 일정한 경도로
(박절에 적합한 형태로) 단단하게
경화시키는(준비시키는) 과정
⑴ 경화방법
① 동결: -20℃이하
② 지지 물질을 조직내 침투
⑵ 경화원리
① 결정화(Crystalization)
ⅰ. 원리: 고온(액체) →저온(고체)
ⅱ. paraffin, Carbo wax gelatin 등
ⅲ. 융점(mwlting point)이 60℃전후
ⅳ. 단점: 조직을 60℃정도의 고온 처리
② 용액 휘발(Evaporation of solvent)
ⅰ. 원리: 묽은 용액 상태로 침투 →용매 휘발
ⅱ. celloidin(Nitrocellulose)
ⅲ. 장점: 실온 침투 가능
ⅳ. 단점: 시간이 많이 소요(4주)
③ 중합법(Polymerization)
ⅰ. 원리: 도량체(monomer) ⇒ 중합체(polymer)
중합개시제 첨가
⑶ 포매방법
① 포매 mold에 녹은 paraffin을 붓는다.
② paraffin이 굳기 전에 병변 부위를 하향하여 조심스럽게 안착
시킨다.
③ 기포의 형성유무를 살피고 조직은 전면이 바닥에 잘 밀착되었
나 확인한다.
④ paraffin 표면에 얇은 막이 형성될 때 환자 label을 붙인다.
⑤ 냉소에서 균등하게 냉각시켜 굳힌다.
⑷ 포매시 조직의 방향 설정법
① 일반조직 - 넓은 부위가 하향
② 난관 맹장등 관상조직 - 횡단면과 종단면의 하향
③ Skin- 표피 진피가 다 나오도록 심는다.
④ 장관조직(위,소장등)- 점막층, 점막하층, 근층 장막층이 다
나오도록 세워서 심는다.
⑤ 림프절 - 절반을 잘라서 넣는다.
⑥ 근육,신경조직 - 횡단면, 종단면으로 여러조각 나누어서 심는
다.
⑦ 수술경계부위 - 먹물로 표시
⑧ 방향 설정이 중요할 경우에는 먹물로 표시
⑨ 침생검 조직의 경우 - 크고 작은 순서를 반복 or 길이 순으로
포매
⑸ 포매 몰드의 종류
① 'ㄱ'자 철제(2개) - 상자크기를 조절할 수 있다. 작업 속도는
느리다.
② Mansonite tray
③ Base mold - embedding ring tissue Cassete 이용
⑹ 포매시 이용되는 기구
① 포매기(embedding center) ② Base mold, Plastic ring
③ "ㄱ" 자형 철재 ④ 핀셋
⑺ 파라핀 포매의 장,단점
① 장점 - 얇은 박절
- 과정이 신속
- 연속 절편 (Ribbon 형성)
- 블록 보관이 용이 - 장기간 보존
- 경제적
② 단점 - 고온의 파라핀 ( 조직의 경화 및 뒤틀림 )
- 일부조직은 침투가 어렵다.
- 대형절편 불가
⑻ 포매 센터의 구조와 사용법
① Embedding center: 포매는 집중적으로 작업할 수 있게 설비된
기계
② Paraffin 용해통 및 분주 장치
③ Cryo-plate: 포매된 블록을 굳히는 냉각판
④ warm -plate: 포매할 때 조직과 paraffin이 굳지 않고 녹은
상태로 유지해 주는 온판
⑤ forcep warmer: forcep 끝에 묻은 파라핀이 냉각되어 굳으면
세밀한 작은 조직의 포매에 방해되므로
항상 녹은 상태로 가온이 된다.
⑼ Paraffin warming chamber: 침투과정이 끝난 조직을 포매 전까지
보관하는 곳
⑽ 포매 Center에 의한 포매방법
① paraffin 침투 과정까지 완전히 끝난 조직을 paraffin warming
chamber에 넣는다.
② hot plate의 온도를 60℃정도로 올리고, Cryo- plate의 switch
를 on해 차게 해 놓는다.
③ 가온된 forsep으로 tissue capsule을 꺼내고 조직의 크기를
보아 base mold의 크기를 결정한다.
④ Base mold에 파라핀 채운다.
⑤ 방향을 잘 잡아 조직을 base mold에 안착시킨다.
⑥ Plastic Embedding ring
⑦ Embedding ring에 paraffin을 추가해서 채우고 환자의 인식
label을 붙인다.
⑧ cryo- plate에 올려 놓는다.
⑨ 완전히 굳으면 base mold 때어내고 paraffin block은 얼음판
위에 올려놓고 박절 준비한다.
⑾ 포매의 일반 사항
① 포매전 투명제는 paraffin으로 대체한다.
② paraffin 침투를 너무 오래해도 조직의 위축과 경화가 온다.
③ paraffin 침투시간은 조직의 두께와 조직의 성분에 달려있다.
④ Brain, spinal cord, Skin등은 하루밤 방치해서 침투시킨다.
⑤ Embrdding center나 paraffin oven의 온도를 항상 60℃인가
점검한다.
⑥ 병소 부위가 하향되도록 한다.
11. Trimming 삭정
: 삭정이란 block을 박절하기 위해 다듬고 대목에 부착시키는
과정, 요즘은 대목용도인 embedding ring 이나 embrdding
Cassette를 쓰기 때문에 거의 삭정하지 않는다.
12. Microtome cutting 박절
⑴ Microtome의 종류
① biconcave형
② planocave형
③ plano wedge형
④ tool-edge형
⑤ Disposable knife형: 사용도중 칼날이 무디어진 즉시 교환해
사용할 수 있으므로 항상 예리한 칼날을 유지
⑵ 마도후 칼의 검사 - 갈검사대 위에 칼을 얹고 현미경으로 관찰
(X100)
⑶ 박절기(Microtome)
① 회전형 박절기 (rotary microtome): 칼이 고정 블록이 이동,
두께 조절기, 미동손잡이, 자동손잡이
② 활주형 박절기 (Sliding microtome)- 블록이 고정, 칼이 이동
⑷ 박절의 원리와 칼의 고착 요령
① 틈의각(clearance angle): 블록의 표면과 칼날의 절단선 사이에
형성되는 각도, 5-10%가 적당하며 7도가 이상적
② 칼을 당기는 각(knife pull slope angle) 활주로의 축과 block
방향에 대한 각도 동결절편과 rotary microtome의 칼의 당기는
각은 90도로 paraffin 박절의 경우는 45도로 celloidin 박절의
경우는 35도로 맞추는 것이 이상적이다.
⑸ 칼 자체의 마도면의 각(facet or bevel angle): 칼 끝의 양면인
마도면과 마도면의 각으로 잘 연마된
칼의 쐐기의 각 (Wedge angle)은15도이다.
⑹ 박절시 필요한 기구
① 부유 온수조(Water bath)
ⅰ. 박절된 절편의 주름을 펴는데 사용(전에 50%alcohol 사용)
ⅱ. Paraffin이 녹지 않으면서 주름이 잘 펴지게 45-50℃로 맞
춘다.
ⅲ. 부유된 절편이 잘 보이도록 바닥이 검정색으로 되어 있다.
ⅳ. 접착제 처리를 해 준다.
<부착제 사용 방법>
- 부유 온수조에 용해: gelatin 1%
- 슬라이딩 코팅: egg albumin
② 신전기(Slide warmer)
ⅰ. 60℃ 온도를 유지하는 평평한 판
ⅱ. paeaffin의 융점보다 약간 높게 사용(paraffin보다 2~3℃
높게), paraffin oven 30분~1시간
ⅲ. 절편을 슬라이드에 단단히 접착의 목적, 최소 30분간 처리
한다.
☆ Slide 부착제 (adhesive)
: 탈외된 뇌조직등 접착력이 약한 조직들을 염색과정중에 탈
락하기 쉬우므로 부착제를 사용
☆ mayer's egg albumin
- egg white 50ml
- glycerin 50ml
를 여과한다. 방부제로 thymol 결정 한 개를 넣고 냉장 보관
Slide 제작은 Slide glass에 Mayer's egg albumin을 한 방울
얹고 깨끗한 gauze 로 전면에 고루 바른다. (아주 얇게 칠한다.)
⑺ 동결절편 (Frozen section)
① 목적
- 수술 중 신속한 표본 제작(진단을 위해 ,악성유무)
- 지방이나 효소와 같은 특정물질 검출시(60℃이상에서 효소가
불활성화 되기 때문)
- 면역 조직화학적 검사 - 파라핀 절편은 항원이 소실될 우려
가 있으므로
② CO2 동결박절법(satorius type)
- 열의 전도에 의한 동결: 조직을 냉매에 직접 접촉, 냉매의 종
류 (액화질소, 드라이아이스)
- 기화열을 이용하는 방법
③ Cryostat(전기식 동결절편기)
전기를 이용해 -30℃까지 조직을 동결시킬 수 있으며 냉동 캐비
넷 안에 rotary microtome 이 45도 경사로 장착 전기식 동결절
편기를 사용할 때는 고정되지 않은 fresh 한 조직사용
④ 동결시 온도
- 표준 내부 온도: -20℃
- 지질: -30℃
※ 조직에 따라 동결 온도가 달라질 수 있다.
⑤ OCT compound
동결 절편에 사용되는 수용성 포매제
13. Stain 염색
⑴ 염료의 분류
① 천연염료 (Natural dyes): 식물, 열매,곤충 등에서 추출한 염료
ⅰ. hematoxylin: 주로 핵염색에 사용
ⅱ. indigo
ⅲ. carmine: 성염색체, 당원염색, 점액염색
ⅳ. Orcein: 탄력섬유의 증명과 B형 간염의 항원 봉입체를 증명
ⅴ. saffron
ⅵ. Litmus
② 인공 합성염료(Synthetic dyes)
염료 구조 = Benzene + 발색단 + 조색단
③ 산성염료와 염기성 염료
㉠ Acidic dye (음이온성 염료)
ⅰ. 발색단이 염료 분자의 (-)음이온 쪽에 위치
ⅱ.조직내에(+)로 하전성분에 결합(세포질,교원섬유 등)
ⅲ.Na(양이온,salt 상태로 판매, chromogen + Auxochrome) ⇒
수용액에서는 음이온으로 대전
ⅳ. 원자기 COOH, OH, SO3H 일반적 성질은 alcohol에 잘 녹지
않고 물에 잘 녹는다.
㉡ Basic dye (양이온성 염료)
ⅰ. 발색단이 염료분자의 (+)양이온 쪽에 위치
ⅱ. 주로(-)로 하전된 부위에 결합(핵산(DNA, RNA,핵)
ⅲ. Cl(음이온,chromogen+Auxochrome)⇒alcohol에 잘녹는다.
⑵ 염색의 적용
: 염색은 생조직이나 고정된 조직의 다양한 조직 성분과 세포구성
성분을 착색시켜 이를 잘 구별하려는 목적으로 시행
① 생체내 염색
- 생체내 염색 살아있는 동물 체내에 직접염료를 주입
- 사용하는 염료: 실험 동물에 무해한 염료(Trypan blue)
- 목적: 탐식 세포 계통 연구
② Supervital stain(초생체 염색)
- 떼어낸 살아있는 세포를 염색
- 사용염료
: Janus green(미토콘드리아 염색), Neutra red(용해소체 염
색), Methylene blue(신경섬유 염색)
③ 진행성 염색 (progressive stainning)
: 현미경하에서 염색을 진행시키다가 조직내의 원하는 부분과
그외의 부분이 구분이 될 때 염색중단
ex) Mayer's hematoxylin 핵염색
④ 퇴행성 염색 (regressive stainning)
: 전체조직을 염색한 다음 원하지 않는 부분에 과염된 염료를
감별과정을 거쳐 제거한다.
ex)Gram stain Harris hematoxyl 핵염색
* Differention 감별: 고정된 염료를 제거하는 방법 감별제
① 산성용액 염기성 용액
② 고농도의 매염제
③ 완충액 (pH 6.0~6.5)
wright stain 할 때 Eosin pH6.5에서 탈색 Methylene pH6.0
에서 탈색
④ 산화제: pot.permangnate, ferricyanide, bisulfite
⑶ 염색반응
① 물리적인 면
ⅰ. 용해성 반응: 염료의 분산도 및 조직 구성 밀도
ex)지방염색 - sudan dye
ⅱ. 흡착성 반응: 거치른 구조의 조직: 큰 입자의 염료
조밀한 구조의 조직: 작은 입자의
② 화학적인 면
ⅰ. 염기성 염료(+): (-)음으로 하전된 조직(DNA, RNA, 인지
질, 비만세포, 연골, 일부 점액 등)
ⅱ. 산성 염료(-): (+)양으로 하전된 조직(교원섬유, 호산구
과립, 세포질)
③ 염색반응에 영향을 주는 요인
ⅰ. 염색액의 이온 강도
ⅱ. 염색액의 농도
ⅲ. 고정농도
ⅳ. 온도
⑷ 일반염색 (Routine staining) H&E stain
① Hematoxylin ⇒ Hematein
자연산화(O2)
인공산화(Mercuric oxide, sod. Iodate, Ferric
chloride)
Hematein(염료) + 매염제 ⇒ Hematein-lake
매염제(Amm or pot alum,
Ferric chloride,
Phosphotungstic acid)
※ 매염제에 따른 Hematoxylin의 분류
⑴ Alum. hematoxylin - 핵염색액
① Harris hematoxylin 용액 (퇴행성 염색)
A용액 - hematoxylin crystal 5g
- 무수 alcohol 50ml
B용액 - ammnium 또는 pot. alum 100g
증류수 1000ml
C용액 - Mercuric oxide red(산화제) 2.5g
Mercuric oxide를 한번에 다 넣는 것은 급격한 산화를 유발하여
용액이 튀어나와 위험하다.
(검은 자주색으로 변함) 다시 한번 더 끓인 다음 찬 물에
신속히 냉각 핵 염색에 사용할 때
용액 250ml당 G.A.A를 10방울 정도 가해주면 핵 염색이 증진
② Mayer's hematoxylin 용액 (진행성 염색)
③ Ehrlich hematoxylin 용액
④ Delafield hematoxylin 용액
⑵ Iron hematoxylin
① weight iron hematoxylin 용액: 특수 염색시 핵 염색
② heiden hain's hematoxylin 용액: 원충류 세포봉입
체, Myerlin sheath
⑶ Tungsten hematoxylin
① Phosphotungstic acid hematoxylin(PTAH): 횡문근 염색
② 세포질 염색액: 핵 이외 물질 염색(세포질, 근육 결합조직)
ⅰ. 산성염료 eosin Y (pinkish-red) 특이성이 낮다.
ⅱ. 2% Eosin 수용액
Eosin Y 수용액 ----5g
증류수 ----------250ml
G.A.A -----------0.5ml
⑸ 염색의 일반적 과정
탈파라핀 →함수 →수세 →염색(Harri's Hematoxylin: 핵염색) →
수세 →분별 →수세 → 중화 →수세(청색화) →Eosin(핵 이외의 세
포질 염색) →탈수 →투명 →봉입
① 탈 파라핀 과정
: 조직 내에 침투한 파라핀과 조직 외부에 포매 된 paraffin을
제거하는 과정, Xylene이 주로 쓰인다.
② 함수(hydration)
: 고농도의 alcohol에서 저농도의 alcohol을 단계적으로 거친
다음 증류수로 수세
목적: 염색액이 대부분 수용액 상태이기 때문에 ex) 100%--->
100%--->95%--->95%--->80%--->70%
③ 염색(퇴행성)
- Hrris hematoxylin (5-6분)
- 수세 (흐르는물)
- 0.5-1% HCl in 75% alcohool(5-10 dips): 감별제
- 수세
- Amm. water (0.3%): 3 - 5dips "청색화 " (blueing)
- 수세
- eosin 2-3분(세포질 염색)
④ 탈수 투명 과정
ⅰ. 탈수: 95%⇒95%⇒100%⇒100% (저농도⇒고농도)
ⅱ. 투명 Xylene
: 불완전한 탈수의 원인은 대개 탈수용액을 거치는 시간이
짧을 때, 탈수용액에 물이 오염되었을 때
14. Mounting (봉입)
: 염색이 완료된 조직 표본에 봉입제를 묻힌 cover glass 씌우
는 일
⑴ 봉입제의 종류
① 수용성 봉입제: 지방염색, 변색성 염색, 면역 형광염색, 면역효
소염색, 조직 효소염색에 사용
ⅰ. Glycerin
ⅱ. Glycerin-jelly
ⅲ. 물
ⅳ. Apathy gum syrup
ⅴ. Crystal mount
② 비수용성 봉입제
ⅰ. canada balsam (Xylene으로 동？U혼합해서 사용, 천연수지)
ⅱ. Permount
ⅲ. HSR(Histoclard)
ⅳ. Enkitt
ⅴ. Ceder wood oil(immersion oil)
⑵ 봉입의 목적
① 절편의 손상 방지
② 부패(습기, 세균) 방지
③ 퇴색방지
⑶ 봉입제의 조건
① 접착성
② 무색, 투명
③ 굴절율(RI)이 조직의 평균 굴절률(1.530~1.540)과 비슷한 것
④ 염색 결과에 영향을 주지 않는 것
< Special stain >
※ 목적: 일반염색으로는 감별할 수 없는 특정물질을 관찰하기 위해
특수 염색을 한다. 일차적 H&E stain을 한다. 이차적으로
H&E stain으로 불가능한 성분을 염색한다.
1. Collagen fiber(아교섬유)염색
⑴ 의의: ①근섬유와의 구별 ② 간경변증 심장질환등 섬유화증
③ 종양세포의 발생학적 기원을 분별
⑵ Van Gieson's fushin-picric acid Stain
① 원리: 강산성 용액상태에서 교원섬유가 산성용액을 선택적으로
흡착함을 이용. (두가지 산성 염료가 혼합된 염색액에서
아교섬유와 근섬유가 선택적으로 착색)
② 주시약: Weight iron hematoxylin(핵: 청색)
Van Gieson solution = picrofuchin (yellow)
- saturated picric acid(포화수용액)
- 1% acid fuchsin
- Hcl
③ 방법: ⅰ. 탈 paraffin , 함수, 수세
ⅱ. weight iron hematoxylin - 10분 염색
ⅲ. 유수에 수세 (핵을 청색) - 10분
ⅳ. Van Gieson solution에 염색 - 5분
ⅴ. 수세 없이 바로 탈수, 투명, 봉입
④ 결과: Collagen fiber ⇒ red
Muscle, Cytoplasm ⇒ yellow
Nuclei ⇒ Blush black
⑶ Masson's trichrome stain
① 원리
ⅰ. 전체를 산성염료 염색(Acid fuchsin+Beibrich scarlet)
ⅱ. Phosphotungstic acid+Phosphomolybdic acid(아교섬유에만
선택적 결합, (-)전하)
ⅲ. Aniline blue(청색염료)반응(아교섬유만 청색 염색)
② 주시약
ⅰ. 고정제로 Bouin용액을 사용한다.
ⅱ. Weight iron hematoxylin(blue): 핵염색
ⅲ. Biebrich scalet-acid fucshin(red): 교원섬유와 근섬유를
염색
ⅳ. Phosphmolybdic-phosphotungstic acid
: 교원섬유에서 Biebrich scalet이 밀려나고(탈색) 금속염
이 교원섬유에 결합되어 (-)전하를 제공하게 된다.
ⅴ Anilin blue(산성pH에서 (+)로 하전) 교원섬유는(청색)으로
된다.
③ 방법
ⅰ. 탈파라핀, 함수 수세
ⅱ. 매염(Bouin용액, Picricacid): 56℃ 1시간
ⅲ. 색소(노란색) 제거: 흐르는 물에 10분
ⅳ. 핵염색(Weigert Iron hematoxylin)
ⅴ. 수도수에 10분(흑청색 형성)
ⅵ. 본염색(Acid fuchsin-Beibrich scarlet): 전체 적색
ⅶ. 분별(PTH+PMA): 아교섬유(-)전하
ⅷ. 아교섬유염색(Aniline blue): 청색
ⅸ. 수세없이 바로 탈수, 투명, 봉입
④ 결과: Collagen fiber - blue
Muscle, Cytoplasm - Red
Neuclei - Blushi black
☆ 접착제로 egg albumin을 쓴다.
⑷ PTAH stain(Phosphotungstic acid hematoxin)
① 원리
ⅰ. 염료+매염제(lake) →핵, 근육세포(청색)
ⅱ. Tungstein ion →아교섬유(오렌지색)
② 주시약: Hematoxylin 1g
PTA 20g
D.W
③ 방법
ⅰ. 탈파라핀, 함수, 수세
ⅱ. 매염과정(Zenker용액)
ⅲ. Mercuric chloride
ⅳ. Iodine, Sod.thiosulfate
ⅴ. 본염색(PTAH 용액): 56℃ 1시간(90분)
ⅵ. 탈수, 투명, 봉입
④ 결과: 근섬유 - 청색, 아교섬유 - 오렌지색, 핵 - 청색
☆ PTAH 용액의 조성: 1:20의 비율
☆ 산화제: 자연산화(O2), 인위적 산화(Pot. permanganate)
☆ 횡문을 잘 볼 수 있는 염색법이다.
☆ 신경조직의 별아교세포(Astrocyte)를 증명할 수 있다.
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