[◈혈액학◈]말초혈액의 도말표본

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말초혈액 도말검사에 대하여

일반혈액검사에서 가장 기본적이며 중요한 검사중의 하나인 말초혈액감별검사는 혈액세포의 형태학적 특징이나 기능을 이해하는 것이 세포의 대사, 증식, 성숙과정과 세포를 감별하고 동정하는데 매우 중요하다. 그것은 각종 혈액 질환을 진단하는데 키포인트가 되어 정확하게 형태를 구분하여주는 것이 임상적 진단에 필요한 정보를 제공하고 적절한 실험방법을 선택하게 하여 환자에게 치료를 할 수 있게 한다. 이런 특이한 세포들은 미성숙하고 비정상적인 형태를 갖고 있으므로 신속하고 정확하게 세포들을 구별할 수 있는 지식을 갖고 있는 것이 중요하다. 그러므로 적혈구와 백혈구의 형태학적인 특징을 숙지하여 정확한 결과를 보고하여 환자의 진단과 치료에 도움이 될 수 있도록 하여야 한다.

1. 말초혈액 검사의 목적

1) 진단에 필요한 정보제공

2) 진단확립에 필요한 적절한 실험방법의 선택

3) 적절한 치료에 필요한 정보제공

4) 화학요법 및 방사선 치료시 발생하는 부작용에 대한 정보제공

2. 혈액세포의 성숙과 증식과정

① 세포질 성숙(Cytoplasm) : RNA - 점차적 소실

Granule - 숫자적 증가

비특이적에서 특이적으로 됨

과립의 양 - 증가

② 세포핵 성숙 (Nucleus) : 모양 - round or oval로 특성에 따른 여러 형태 나타냄.

염색질 : 섬세, 정밀에서 조잡, 덩어리짐

적자색에서 청자색으로

핵소체 : 점차 소실

③ 세포 크기 : 일반적으로 크기가 작아짐

3. 말초혈액 도말표본의 작성법

1) 방법 : ① coverglass법

② 슬라이드법 : 깨끗하고 기름기 없는 슬라이드가 좋다.

더러운 슬라이드는 24시간동안 세척제로 닦고 수돗물에 닦은 다음 증류수에 세척 후 95%알코올에 넣어 말려서 사용한다.

③ buffy coat법

2) 슬라이드 만드는 과정

① 슬라이드 한쪽 끝에서 1∼2cm 떨어진 곳에 직경 2mm 정도의 혈액 한방울을 놓고 미는 슬라이드를 약 25°각도로 세워 다른쪽 끝에서부터 혈액이 있는 쪽으로 접근시켜 살짝 닿게 한다.

②혈액이 미는 슬라이드 끝을 따라 80%정도 퍼지면 거침없이 반대방향으로 민다.

③각도를 조절하여 도말이 반대편 끝에서 1∼2cm 되는 곳에서 끝나게 밀어야한다.

④공기 중에서 흔들어 말린 후 도말의 두꺼운 쪽에다 연필로 피검자의 이름을 써두어 서로 바뀌지 않게 한다.

3) 주의점 : 각도, 속도, 혈액 양

4. 혈액도말 염색방법

1) 방법

Romanowsky type 염색 : 현재 사용되고 있는 혈액도말 표본의 염색을 총칭하며 염기성

색소인 methylene blue와 산성 색소인 eosin이 포함 된 염색액

을 사용하는 방법.

① Wright method : 간편하고 염색시간이 빨라서 많이 사용되며 호중성 과립의 염색이 잘됨.

② Giemsa method : 핵의 염색이 잘됨.

③ Wright-Giemsa method : 핵의 염색성이 우수한 Giemsa액과 과립의 염색이 우수한 Wright 염색의 장점을 보완한 것.

2) 주의점 : 염색시간, 세척시간, PH

① 핵은 파랗게 세포질은 붉게 보인다.

② 육안으로 봐서 청색 또는 자색이면 과 염색, 세척미비 등의 이유 때문에 알칼리 성으로 기운 것이다.

③ 육안으로 분홍색이면 산성으로 기운 것이나 이때는 과 세척, 불충분한 염색시간.

5. 혈액도말 판독

1) 관찰 순서

100배, 200배 : 혈구의 분포양상, 혈구의 수, 특별한 세포 등 관찰.

1000배 : 각각의 세포형태를 세밀하게 관찰.

2) 관찰 방법

Ideal zone : "ㄹ"자 형태로 움직이면서 관찰.

6. 혈액세포 감별의 판단 기준

1) 세포질의 특징 : ⓐ 과립 유무 : 특이적 또는 비특이적

ⓑ 염색상 : 전체적인 염색정도에 주의해야함

ⓒ 상대적 양

2) 세포핵의 특징 : ⓐ 염색질 양상 - 섬세한가? 거친가?

ⓑ 상대적 크기

ⓒ 핵소체의 유무

ⓓ 모양

3) 세포의 크기 : 대, 중, 소

7. 적혈구 관찰

1) Hemoglobin content

- Normochromia : 혈색소량이 정상인 경우.

- Hypochromia : 혈색소량이 적은 상태.

철 결핍성 빈혈인 경우.

- Hyperchromia : 혈색소량이 과포화상태.

2) Size(크기)

- Normocyte : RBC가 6∼8㎛.

- Microcyte : 6㎛이하 - Iron deficiency anemia, thalassemia, sideroblastic anemia.

- Macrocyte : 8㎛이상 - Megaloblastic anemia, hemolytic anemia, liver disease.

- Anisocytosis(적혈구 대소 부동증)

3) 모 양

여러 질환에 의해서 적혈구의 형태가 불규칙하게 변하는데 이런 불규칙한 형태를 보이는 적혈구를 poikilocyte라고 하며 poikilocyte가 많이 나타나는 경우를 변형 적혈구 증가증(poikilocytosis)라고 한다. poikilocytosis는 대부분 anisocytosis를 동반한다.

- 정상 : 정상상태의 적혈구는 일정하게 원반 모양으로 보인다.

-spherocyte : 정상 적혈구는 biconcave 하게 생겼기 때문에 중심부가 맑게 보이 지만 이것이 부풀어 올라오면 직경은 오히려 줄면서 중심부의 맑은 부분이 없어진다. 이를 구상적혈구라고 말하며 선천성 구상 적혈구증 또는 후천성 자가 면역성 용혈성빈혈에서 흔히 나타난다.

- ovalocyte : 구형이 아니고 난형을 보이는 세포로 eliptocyte라고도 한다. 선천적인 경우 용혈성 빈혈에서 나타난다.

-Target cell : leptocyte라고도 불리며 중심부의 맑은 부분에 다시 중심점이 사격에 쓰는 표적같다고 하여 표적 세포라고 불린다. 지중해성빈혈(cooly's anemia)때 많이 나타나며 혈색소이상질환 만성 간 질환, 비장적출 후 등에서 보인다.

- Burr cell : 주위에 뽀족한 가시가 돋힌 적혈구인데 뇨독증, 위암 및 출혈 또는 소화기궤양 환자 등에서 볼 수 있다. 채혈 후 두 시간 이상 경과 후 도말 할 때 만들어진 crenated cell과는 구별되어야 한다.

- Spur cell : 주위에 허족(pseudopod)처럼 다리를 낸 모양으로 보이는 적혈구인데 간 질환 환자에서 흔히 볼 수 있다. 이는 적혈구막에 lecithin등의 지방성 물질이 축적되어서 그런 모양을 낸 것이다.

4) 염색성의 이상

- Normochromia : 적혈구 중심부의 맑은 부분(central halo)이 직경의 약 3분의 1 정도를 차지하는 정상상태를 말하며, 이것은 적혈구의 헤모글로빈 함량이 대체로 정상이라는 것을 의미한다.

- Hypochromia : 중심부의 맑은 부분이 확장된 적혈구를 말하며, 특히 심하면 적혈구의 윤곽만 나타나고 내용이 빈 것처럼 보이는 anulocyte가 된다.

- Hyperchromia : 중심부의 맑은 부분이 없는 적혈구를 이렇게 표현할 수 있으나 이것은 헤모글로빈 농도가 더 높다는 뜻은 아니다. 흔히 macrocyte나 spherocyte가 이렇게 보인다.

- Polychromatophilia : 제대로 염색이 된 붉은 적혈구 사이에 퍼렇게 염색이 되는 다소 큰 적혈구를 볼 수 있는데 대개는 아직 덜 성숙한 망상적혈구들이 이렇게 나타난다. 이때 중심부의 맑은 부분은 보이지 않게 된다. 용혈성 빈혈 등 망상적혈구가 증가된 질환에서 관찰된다.

5) 이상구조물

- Basophilic stippling : 적혈구에 파란 점이 있는 것을 의미한다. RNA의 변화 즉, 적혈구의 성숙 과정의 이상으로 생겨나며 대표적으로 연중독(lead poisoning)때 나타난다. 악성빈혈, 백혈병 같은 때 나타난다.

- Cabot ring : 적혈구속에 나타나는 자색 가락지 모양을 의미하며 단순히 인위적인 구조물로 생각하는 견해가 많다. severe anemia때 나타남.

- Howell-Jolly body : 부서진 핵의 일부가 큰 점으로 한 개 또는 몇 개 파랗게 나타나는 것을 말하며, 이는 비장에서의 적혈구 pitting 기능이 저하되었거나 결여된 상태 즉, 무비증이나 비적출 후 등에서 종종 관찰되며 Vit.B12 또는 엽산 결핍증에서도 나타난다.

- Heinz body : 보통 Wight염색법으로는 염색되지 않고 brilliant crystal blue 같은 생체염색으로만 나타나는 1-2㎛정도의 불규칙한 과립이다. 모양도 크기도 불규칙하여 둥근 Howell-jolly body와는 다르며 적혈구의 가장자리에 위치하는 것이 특징이다. 이것은 변성된 글로빈으로서 특정 약품에 의하여 생기는 용혈성 빈혈과 깊은 관계가 있다.

- Pappenheimer body(siderocyte) : 보통 Wright염색법에서도 청자색으로 나타나나 Prussian blue reaction으로 감별이 되는 철분 과립이 있는 적혈구를 siderocyte라고 부르고 그 철분 과립을 Pappenheimer body라고 부른다. 일반적으로 용혈성 빈혈 때 나타나며 특히 비적출 후에 많이 관찰되는데 이 는 혈색소 형성에 결함이 있고 철분의 이용이 제대로 안될 때 나타난다.

- Rouleaux형성 : 적혈구들이 염주 모양으로 배열되어 있는 것을 말하는데 이것은 만성 염증성 병변 때 나타나는 과단 백혈증 때, 그리고 macroglobulinemia나 다발성 골수종 등에서 흔히 관찰된다.

- Autoagglutination : 적혈구들이 여러 가지 크기로 응집되어 있는 것을 말하는데이는 cold agglutinin disease나 자가면역성 용혈성 빈혈 등에서 흔히 관찰된다.

8. 백혈구 관찰

1) 백혈구 수 측정 : 200배 시야에서 1개당 1000개로 계산한다.

2) 백혈구 감별계산

- 백혈구의 종류(leukocyte)

① 과립구(granulocyte) : ⓐ 호중구(neutrophil)

ⓑ 호산구(eosinophil)

ⓒ 호염구(basophil)

② 비과립구(agranulocyte) : ⓐ 림프구(lymphocyte) - T-cell

- B-cell

ⓑ단구(monocyte)

3) 과립구 계통의 성숙과정

미성숙 백혈구는 정상적으로는 혈액 중에 나타나지 않는다. 과립구나 단구의 미성숙은 골수에서 보이므로 골수 도말 표본을 만들어서 염색을 하여보면 각 단계별로 관찰 할 수가 있다. 그러나 백혈병 등과 같은 질환에서는 말초혈액 도말 표본에서도 인지할 수 있다.

A. 호중성 과립구의 성숙 단계별 특성일람

	Myeloblast	Promyelocyte	Myelocyte	Meta myelocyte	Band	Segment
크기(㎛)	10-18	14-20	12-18	10-18	10-16	10-16
N:C 비율	4:1	3:1	2;1-1:1	1:1	1:1	1:1
핵의형태	round or oval	round or oval	round or Indented	Indented	Distinct curved	lobes
핵인	1-5	1-5	Variable	none	none	none
크로마틴	Reticular	Smooth	Slightly clumped	clumped	very clumped	Denselypacked
세포질내 과립	none	비특이성 과립	Fine specific	Fine specific	Fine specific	specific
세포질양	Scanty	Slightly increased	Moderate	Moderate	Abundant	Abundant
Color	Medium blue	Moderat blue	Blue/Pink	Pink	Pink	Pink

B.Eosinophil의 기능 : 호산구도 호중구와 같은 화학주성(chemotasis), 탐식능력

(phagocytosis) 및 호중구에 비해서 약하지만 살균력도 갖고있다.

① 항원-항체 복합물을 탐식함으로써 allergy 반응의 억제

②Allergy반응 시에 일어나는 호염기구의 histamine 방출을 억제함으로써 histamine 에 의한 조직손상 작용의 방지

③ 기생충, 천식, allergy반응에 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다.

C. Basophil 의 기능

① Histamine방출에 의해 anaphylaxy shock, 두드러기, 기관지천식, allergy 반응을 일으킨다

② 호산구를 끌어들이는 주화인자를 방출한다.

D. Lymphocyte

크기 : 7∼18㎛

N:C비율 : 4:1 또는 3:1

핵의 형태 : Round or indented

핵의 위치 : one side or round

핵의 색조와 크로마틴 구조 : coarse blue-purple nuclear chromatin

핵소체 : Usually absent, rarely one seen in mature form.

세포질의 양과색조 : Light clear sky blue, scanty to moderate.

세포질 내 과립 : Usually absent, occasionally few azurophilic granules seen.

E. Monocyte(단구)

크기 : 15∼25㎛(말초혈액 중에 나타나는 세포 중 가장 크다)

N:C비율 : 2:1 또는 1:1

핵의형태 : Round, Kideney형, 때에 따라서는 핵이 굴곡됨.

핵의 위치 : 중심성

핵의 색조와 크로마틴 구조: Blue purple, 뇌 회선 주름모양

핵소체 : 없다.

세포질의 양과색조 : 풍부하고 dull gray blue, 가끔 위족을 볼 수 있다.

세포질 내 과립 : 수많은 아주 미세한 연한 붉은색의 먼지와 같은 과립들이 고르 게 분포9. 혈액 기생충

말라리아의 형태학적인 감별.

- 적혈구 내에 기생하는 원충으로 Plasmodium(P).falciparum(열대열 원충), P.vivax(삼일열 원충). P.malariae(사일열 원충) P.ovale(난형열 원충)의 4종이며 각 발육시기의 형태에 의해 감별이 가능하다.

- 제일 많은 것은 P.vivax(삼일열 원충)에 의한 감염이고 다음이 열대열 말라리아 이다. 검색에는 혈액농축 도말표본을 약염기성(PH7.2의 완충액 사용)로 염색하는 것이 중요하다.

10. 혈소판 관찰

혈소판은 거핵구 세포질의 파편으로서 직경 2∼4㎛로 원판형 또는 난원형, 방추형 등 불규칙하며 핵은 없고 세포질은 연청색으로 염색되며 일정하지 않은 수의 작은 적자색의 과립이 고르게 퍼져있다.

1) 혈소판 수 측정 : 1000배 시야에서 1개당 20,000개로 계산

2) 혈소판 형태의 관찰

- platelet

- giant platelet

- platelet clumps

11. 말초혈액상 관찰의 주의점.

1) 혈액세포는 환자의 증상에 따라 극히 민감하게 반응한다. 그 병태를 정확하게 반응시키는 표본제작이 말초혈액상 관찰에 있어서 전제조건이 된다. 완전한 표본을 만드는 것이 정확한 성적을 내는데 필수 조건이라고 생각하는 자세를 견지해야하겠다.

2) 정확한 표본의 관찰법에 대하여 주의할 점은 백분비를 내기전에 표본의 전체상을 파악해야 한다. 우선 약확대로 표본의 도말상태, 염색성을 확인한다.

3) 이어 적혈구, 백혈구, 혈소판 수의 증감을 파악한다. 적혈구는 ideal zone에서 보는 것이 중요하며 적아구가 출현하면 백혈구 수의 보정이 필요한지를 파악한다. 혈소판은 응집이 있는지를 파악하며 가짜 혈소판 감소가 보이는 수가 있으므로 주의를 요한다. 백혈구의 증감을 볼 때에는 특히 증가 또는 감소하는 세포의 종류에도 주의를 기울인다.

4) 약확대에 의한 관찰 후 유침(강확대)에 의한 질적인 변화 즉 형태학적 관찰을 하여야 한다.

5) 정상적인 형태의 도말표본으로 형태를 숙달시켜야하며 늘 수치를 아는 양호한 표본으로 안목을 길러놓는 것이 절대적으로 필요하다.