PAS(Periodic Acid Stain)
1. 검사명 : PAS(Periodic Acid Stain)
2. 검사원리 : 백혈구 및 적아구에는 polysaccharide, mucopolysaccharides, mucoprotein, glycoprotein 등이 존재한다. 이들 protein과 결합된 carbohydrate기가 periodic acid에 의해 산화되어 aldehyde 기를 생성하고 이것이 Schiff's reagent와 작용하여 붉은 자주색을 띈다.
3. 검체 채취 용기 및 검체 적합성 판단기준
1) Formalin에 오염되지 않은 slide
2) 항 응고제(EDTA)가 들어있는 혈액이나 골수 도말한 slide
3) 너무 희석되지 않은 검체로 만든 slide
4. 시약
1) Periodic acid sol.(periodic crystal 5g을 100ml DW에 녹여서 사용) : 냉장고에 보관하고 사용전에 실온으로 되게하여 사용하며 유효기간을 적어놓는다.
2) Schiff's reagent : 냉장고에 보관하고 사용전에 실온이 되게한다.
3) Mayer hematoxylin solution
4) 고정액(Alcoholic formalin) : 37% formalin 10ml + ethanol 90ml
5. 정도관리 물질 : neutrophil이 많은 slide
6. 장비 : microscope
7. 검사방법
1) 말초혈액이나 골수도말표본을 공기중에 말리고 고정액에 10-15 분 고정한 후 흐르는 물로 15분간 수세 한다.
2) Periodic acid에 10 분간 놓아둔다.
3) 흐르는 물에 10분간 세척한다.
4) Schiff reagent로 37에 30분간 염색한다.
5) sulphurous acid 에 10분간 놓아둔다.
6) 흐르는 물에 충분히 5 분정도 세척한다(pink color).
7) Mayer hematoxylin에 30 분간 대조 염색한다.
8) 흐르는 물에 10분동안 세척한다.
9) 공기중에 말린 후 봉입하여 현미경으로 관찰한다.
9. 결과 및 보고방법
1) Neutrophil과 megakaryocyte는 양성을 보이며 분홍색이나 적색으로 보인다.
2) Monocyte는 fainty pink색의 fine or coarse granules를 가진 것으로 보인다.
3) Erythrocyte는 염색되지 않는다.
4) Lymphocyte나 lymphoblast는 양성으로 보일 수도 있다.
10. 검사 결과의 임상적 의의 cell type
PAS Reaction
Myeloblast
negative or rarely weakly positive
Promyelocyte, myelocyte and metamyelocyte
diffusely mildly positive
Band and neutrophil
diffusely strongly positive
Lymphoid cell
negative or a few small PAS positive granules
Monocyte
fine pink granules or a few small PAS positive granules
Platelet and megakaryocyte
diffuse red staining and scattered red
granulation, rarely a few fine pink granules
Normoblast
rarely a few fine pink granules
Reed-Sternberg cell
negative
Sezary cell, Gaucher cell
myeloma cell and histiocyte
may be positive
Amyloid, reticulin and fibrin
may be positive
Non-specific Esterase Stain
1. 검사명 : Non-specific Esterase Stain
2. 검사원리 : 백혈구의 esterase는 naphthalene derivative를 가수분해하여naphthol compound를 내는데 이것이 diazonium salt와 결합하여 enzyme activity가 있는 부위나 혹은 그 주위에 colored precipitate를 만든다.
3. 검체 채취 용기
1) Formalin에 오염되지 않은 slides
2) EDTA 항응고제가 섞인 혈액이나 골수로 도말한 표본
4. 검체 적합성 판정 기준
1) 너무 희석된 검체로 만든 slide는 부적당하다.
2) 당일검체를 사용하며 가능하면 빛의 노출을 차단한다.
5. 시 약
i. None specific esterase stain( Sigma, USA )
1) 고정액 : Citrate solution-------------------------------------- 50ml (citrate Sol. 25ml + acetone 65ml + 37% formaldehyde 8ml)
2) 반응액
- α-naphythyl butyrate solution, (냉동보관)
- pararosaniline solution (냉장보관)
- sodium nitrite tablets (냉장보관) : DW 62.5ml + 10 tablets
- phosphate buffer (냉장보관) : DW 500ml 혼합 pH 7.7
- citrate solution (냉장보관)
3) 대조 염색액
- methylene blue solution (냉장보관)
6. 장비 : Microscope
7. 검사방법
① Phosphate buffer 40ml을 coplin jar에 넣고 37에 5분간 넣어둔다.
② 1.5ml sodium nitrite solution 1.5ml 에 pararosaniline solution 1.5ml을 ①에 첨가한다.
③ α-Naphthyl butyrate solution 5ml을 에 첨가한다.( 냉동실에서 거내 37℃ 에 prewarm 한다.)
④ 10 초간 고정액 (citrate-acetone-formaldehyde)에 고정한 후 반드시 증류수로 세척한다. (* slide를 건조시키면 안된다.)
⑤ 37℃ 에 1시간 incubation 한다.
⑥ tap water로 2-3분간 세척한다.
⑦ 5분간 methylene blue counter stain 한다.
⑧ D.W.로 세척한다.
⑨ 봉입하여 검경한다.
8. 결과 및 보고방법
1) 양성 : 단구에는 α-naphthyl acetate activity가 있으므로 양성이다. megakaryocytes, histiocytes
2) 약양성 : 비정형 림프구, 림프종의 분화가 안된 림프구
3) 음성 : 호중구 과립구의 전구 세포
Sugar Water
1. 검사명 : Sugar Water Test
2. 검사원리 : Paroxysmal noctural hemoglobinuria(발작성 야간 혈색소뇨증) 환자의 적혈구는 보체를 포함한 low ionic strength의 혈청에 노출되면 용혈되나 정상인의 적혈구는 용혈되지 않는다.
3. 환자준비 : 환자와 동일한 혈액형의 정상인을 대조로 검사한다.
4. 항 응고제 : double oxalated : whole blood = 0.5ml : 4.5ml
※ 단, EDTA blood or heparinized blood는 사용하지 말아야 한다.
5. 시 약 : 10% sugar water solution(상품화된 설탕 10g / 증류수 100ml)
6. 정도관리 물질 : 동일한 혈액형의 정상인 혈액
7. 장비 : 15ml conical centrifuge 튜브 & pipets
8. 검사방법
1) 9.5% sugar water sol. 9ml + 1ml whole blood → mix
2) 실온에서 30 분간 방치한다.
3) 원심분리(1500rpm/10min) 후 용혈여부를 육안으로 판독한다.
( 정상인의 혈액은 같은 방법, 환자의 검체를 1ml + saline9ml 로 동시에control로 한다.)
9. 결과 및 보고방법
1) 용혈이 보이면(10%이상) 양성으로 판정하고 용혈이 보이지 않으면 음성으로 판정한다.
2) 양성이면 확인검사를 위하여 Ham's test를 반드시 해야한다.
10. 검사결과의 임상적 의의 : PNH 환자의 simple screening 검사이다.
LAP Score(Leukocyte alkaline phosphatase stain)
1. 검사명 : LAP Score(Leukocyte Alkaline Phosphatase Stain)
2. 검사원리 : 기질인 Naphthol AS-BI phosphate는 알카리성 인산요소에 의해 가수분해되어 phosphate + arynaphtholamide를 형성하고 arynaphtholamide는 diazonium salt인 fast red violet salt와 결합하여 호중구내 alkaline phosphatase의 활성도에 따라 불용성인 붉은 침전물을 형성한다.
3. 환자 검체준비 : 환자가 직접 혈액학계에 내려와 손끝에서 혈액을 채혈한 후 slide smear를 3장 준비한다.
4. 검체 적합성 판정기준 : 신선한 말초혈액 도말표본을 말린 뒤 즉시 고정하며 보관 할때는 고정이 끝난 뒤 3 시간정도 말린 후 -20℃에 보관한다.
5. 정도관리 : Neutrophil이 많은 slide를 positive control로 사용한다. 특히( 임산부의 말초혈액)이 좋다.
6. 시약
1) 고정액 : citrated buffered acetone(60%) 냉장보관
(1) 0.03M sod. citrate(8.82g/L), 32ml + 0.03M citric acid 168ml
(2) acetone : 150ml
2) 0.2M propanediol stock buffer sol.(냉장보관)
(1) 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol: 10.5g
(2) DW : 500ml
3) 0.05M propanediol working sol.(pH 9.4 - 9.6)
(1) 0.2M propanediol stock buffer sol.: 250ml
(2) 0.1M HCl(conc Hcl 8.4 ml/L): 50ml
(3) DW: 1000ml 냉장보관 했다가 사용시 실온으로 !
4) 염색액
(1) Naphthol AS-BI phosphate: 5mg
(2) N.N-Dimethylformamide: 0.3ml
이때 물기가 있으면 안되고 충분히 용해되어야 염색이 된다.
(3) 0.05M propanediol working buffer sol.: 60ml
(4) Fast red violet salt LB : 30mg 반드시 여과( filteration )를 한다.
5) 대조 염색액 : Mayer hematoxylin( 1g hematoxylin /50ml DW )
a.Hematoxyline .................... 1g + D.W .................. 500ml
(Heat just to boilling, add another 500ml D.W.)
Sod. iode .............. 0.2g + Amm. Pot. sulfate ............. 50g
( Store in brown bottle at room temp. and filter before use)
b. 1% Methylene blues ............ 1g + D.W. to 100ml
7. 장비 : Microscope
8. 검사방법
1) 신선한 말초혈액이나 heparin으로 처리된 혈액으로 슬라이드를 3장씩 만든다
2) 0 - 4℃의 formalin fixative sol에 30초 , aceton fixative sol에 실온에서 30 초간 고정한다.
3) 흐르는 물에 세척하고 30-60 초간 air dry 시킨다.
4) 염색액에 슬라이드를 넣고10 분간 실온에 방치한다.
5) 흐르는 물에 1분간 세척한다.
6) 37℃에서 정확히 30분간 신선한 substrate mixture에 incubation 한다.
7) 30-60초 흐르는 물에 세척
8) 여과한 염색액(hematoxylin)으로 6 분간 대조염색한다.
9) 흐르는 물에 1-2 분간 세척한다.
10) Air dry 시킨 후 봉입하여 현미경으로 관찰한다.
9. 결과 및 보고방법 : 얇게 도말된 부분에서 neutrophil이나 band를 찾아서 100 count동안 LAP score를 계산하는데 0에서 4까지 등급을 나누어 계산한 후 총 합계를 보고하며 그 기준은 다음 표와 같다.
Table. Characteristics of Scoring Precipitated Azo Dye in Cytoplasm Score reading
Amount
Size of granules
Intensity of staining
Cytoplasm
0
none
N/A
none
none
1
one forth
small
faint to moderate
colorless to pale blue
2
one half
small
moderate
colorless to pale blue
3
three quarter
mediun to large
strong
colorless to pale blue
4
full( all )
medium and large
brilliant
not visible
10. 참고치 : 13-130
11. 검사결과의 임상적 의의
1) 증가 : polycythemia vera, a variety of malignancies, pregnancy, infections/inflammatory disorders, emotional stress, etc...
2) 감소 : paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, chronic myelogenous leukemia
Carboxyhemoglobin ( Co - Hb )
1. 검사종목 : CO-Hemoglobin
2. 검사원리 : Co 는 Hb와의 친화력이 산소의 210배나 되어 공기중에 Co가 있으면 쉽게 체내에서 Co-Hb로 된다.
3.검체채취용기 : double oxalate (혈액학계에서 직접 tube를 타가도록 한다.)
Blood 4.5 ml+Double dxalate 500ul
4. 시 약 : 40% NaOH (2.5N NaOH)
: 2.5N NaOH ------- 1N (40g/l) ------> 2.5N = 100G/l
: 40% NaOH -------- ( 40g/100ml) -----> 40% NaOH
5. 정도관리 : 정상인 대조검사
6. 검사방법 : Tantative Rapid Test ( NaOH Test )
1). D.W 10ml에 Double Oxalated Blood 100ul를 넣어 잘 Mix한다.
( Hb 농도가 비슷한 것으로 Control를 세운다 )
2). 40% NaOH(2.5N NaOH)를 몇방울 떨어 뜨리면 Oxyhemoglobin은 암갈색, Co-Hb는 적색(선홍색)을 나타내므로 back groud를 흰색배경으로 하여 눈으로 확인한다.
7. 계산결과 및 보고방법 : Positive (양성), Negative (음성)으로 보고한다.
8. 검사결과에 영향을 미칠 수 있는 사항 : Hemolysis된 검체는 절대 안된다.
9. 검사결과 : 연탄가스 중독시 적색 (선홍색) ---positive
Prothrombin Time
1. 검사명 : Prothrombin Time & Fibrinogen
2. 검사원리 : 검체속에 있는 혈액 응고 인자와 시약을 혼합하여, 혈액응고기전에서 피브리노겐(fibrinogen) 이 피브린(fibrin)으로 전환될 때에 다양한 강도를 가진 램프에서 방출되는 빛 (405nm, 550nm)을 검체에 투과시킬 때, 검체가 응고될때에 통과되는 빛을 광 감지기가 감지하여 전자신호를 이용하여 응고형성을 감지하게 된다.
이때 응고가 시작될때의 light scatter 강도의 증가는 PT 와 관련이 있다.
3. 검체 준비
1) 3.2% sodium citrate 0.3ml이 들어있는 튜브에 전혈 2.7ml
* Hct에 따른 항응고제 비율
6%일때 1 : 5 45%일때 1 : 9
20%일때 1 : 6 55%일때 1 : 11
30%일때 1 : 6 63%일때 1 : 13
2) 채혈 즉시 응고가 일어나지 않도록 10 회정도 혼합한다.
3) 원심방법 : 3000 rpm 에서 10 분
4) 보관방법 : Factor V는 파괴되기 쉬우므로 채취후 가능한한 빨리 혈장 분리하여 실온 보관시 2시간, 냉장온도는 4 시간이내 검사를 실시하여야 하며 -20℃에서는 2 주간, -70℃ 에서는 6 개월간 보관 가능하며, 검체의 해동시에는 37℃에서 재빨리 녹여 즉시 검사 를 실시한다.
4. 검체 부적합성 판정 기준
1) 용혈된 검체
2) 지방성인 검체(lipemic sample)
3) 항응고제(anticoagulant) 비율이 맞지 않는 검체
(항응고제 : 혈액 = 1 : 9 ----- Hct이 45%일 때)
4) 응고가 일어난 검체(부분적 응고라도 부적합)
5) 헤파린이 섞인 검체
6) 검체 채취후 너무 오래 경과한 경우
7) 혈소판 풍부 혈장을 사용했을때
5. 시약
1) thromboplastin-DS : 증류수 4ml로 희석하여 미리 준비 한다.
2) Control plasma : 증류수 1ml로 희석하여 15분후 약하게 mix하여 사용한다.
(유효기간인 것을 확인하며 검사직전 시약을 확인한다.)
6. 정도 관리 물질
1) Normal control plasma(day & night shift)
2) Abnormal control plasma (day & night shift)
3) Pool plasma
* 정도 관리 측정치 허용범위
검사실 자체의 허용범위를 설정하고 reagent lot가 바뀌거나 장비에 변경사항이 있을 경우 다시 설정한다. 항상 측정치는 기록하고 이미 설정된 허용범위와 비교한다. 허용범위를 벗어나는 경우 우선 정도관리물질의 유효기간을 확인하고 장비점검을 마친 후에 재검사를 실시한다. 재검후에도 허용범위안에 들지 않으면 계장에게 보고하여 장비를 재점검하고 문제를 해결할 수 있도록 하며 문제발견시 A/S를 받도록 한다.
자체의 허용범위를 설정하기 전에는 제조회사에서 제시한 다음 범위를 참고한다.
제조원: Ortho Diagnostic Systems Inc
상품명: Ortho Plasma Cagulation Control Level I, Level II
설정장비: semiautomated optical density end-point detector
Mean
Range
Replicate
Vial-to-vial
Lot-to-lot
Level I
12.7
± 0.2
± 0.14
± 0.25
Level II
31.7
± 0.64
± 0.48
± 0.40
7. 장비 : ELECTRA 1400C (MLA)
8. 검사방법
1) Catch bin 의 부착상태, Tray cover 의 정확한 닫힘을 확인한다.
2) cuvettes 과 wash pump의 양을 확인, 보충시킨다.
3) 전원을 켠다. 6분5초후 ESC를 1번 누르면 MAIN MENU 상태가 된다.
4)시약을 장착시킨다.
( CaCl2 - pump 2, PT - pump 3, PTT - pump 4 )
5) sample을 Tray에 배역시키고 cover는 열어서 tray를 좌우로 돌려서 덜컥 소리가 나도록 고정시킨 다.
6) patient list를 작성한다.
7) 시약을 prime 시킨다.
8) RUN 시킨다.
9) 검사가 끝나면 patients results management에서 해당 file을 전송시킨다.
10) PC에서 특수혈액검사 program을 열어서 전송된 결과를 확인한 후 결과를 출력시킨다.
11) 장시간 MLA를 사용치 않을 경우 시약을 분리해서 냉장고에 보관후 전원을 OFF 시킨다.
9. 결과 및 보고방법
PT① sec (초 : 소수점 이하 첫자리까지)와 INR 값을 보고한다.
② 비 정상적인 결과가 나오면 반복 검사후 결과를 확인한다
③ panic value가 나오면 결과를 누적조회하여 바꾸어 반복 검사후 보고한다.
10. 참고치 PT : 11∼14sec
11. 검사결과의 임상적 의의
(1) 외인계응고기전의 VII, X, V, II, I 응고인자의 유전적 결핍, 간질환, Vit.K 부족으로 인하여 PT가 연장된다.
(2) 혈전증 치료를 위한 경구용 항응고제 사용시 이중 VII 인자는 외인계 응고인자중 가장 먼저 영향 을 받는다.
12. 검사 결과에 영향을 미칠 수 있는 요인
1) 2 시간 이내에 검사하여야 한다.
2) 혈장을 미리 가온하는 시간을 초과하지 않도록 한다(37℃에서 시행).
3) 섬유소원의 농도가 100mg/dl 이하시
4) 헤파린이 포함된 검체
5) 항 응고제의 비율이 잘못된 경우
13. Panic value : PT값이 26 초 이상이면 반복검사 실시후 주치의나 의뢰부서에 전화로 알려주고 확인한다.
1. 검사명 : PAS(Periodic Acid Stain)
2. 검사원리 : 백혈구 및 적아구에는 polysaccharide, mucopolysaccharides, mucoprotein, glycoprotein 등이 존재한다. 이들 protein과 결합된 carbohydrate기가 periodic acid에 의해 산화되어 aldehyde 기를 생성하고 이것이 Schiff's reagent와 작용하여 붉은 자주색을 띈다.
3. 검체 채취 용기 및 검체 적합성 판단기준
1) Formalin에 오염되지 않은 slide
2) 항 응고제(EDTA)가 들어있는 혈액이나 골수 도말한 slide
3) 너무 희석되지 않은 검체로 만든 slide
4. 시약
1) Periodic acid sol.(periodic crystal 5g을 100ml DW에 녹여서 사용) : 냉장고에 보관하고 사용전에 실온으로 되게하여 사용하며 유효기간을 적어놓는다.
2) Schiff's reagent : 냉장고에 보관하고 사용전에 실온이 되게한다.
3) Mayer hematoxylin solution
4) 고정액(Alcoholic formalin) : 37% formalin 10ml + ethanol 90ml
5. 정도관리 물질 : neutrophil이 많은 slide
6. 장비 : microscope
7. 검사방법
1) 말초혈액이나 골수도말표본을 공기중에 말리고 고정액에 10-15 분 고정한 후 흐르는 물로 15분간 수세 한다.
2) Periodic acid에 10 분간 놓아둔다.
3) 흐르는 물에 10분간 세척한다.
4) Schiff reagent로 37에 30분간 염색한다.
5) sulphurous acid 에 10분간 놓아둔다.
6) 흐르는 물에 충분히 5 분정도 세척한다(pink color).
7) Mayer hematoxylin에 30 분간 대조 염색한다.
8) 흐르는 물에 10분동안 세척한다.
9) 공기중에 말린 후 봉입하여 현미경으로 관찰한다.
9. 결과 및 보고방법
1) Neutrophil과 megakaryocyte는 양성을 보이며 분홍색이나 적색으로 보인다.
2) Monocyte는 fainty pink색의 fine or coarse granules를 가진 것으로 보인다.
3) Erythrocyte는 염색되지 않는다.
4) Lymphocyte나 lymphoblast는 양성으로 보일 수도 있다.
10. 검사 결과의 임상적 의의 cell type
PAS Reaction
Myeloblast
negative or rarely weakly positive
Promyelocyte, myelocyte and metamyelocyte
diffusely mildly positive
Band and neutrophil
diffusely strongly positive
Lymphoid cell
negative or a few small PAS positive granules
Monocyte
fine pink granules or a few small PAS positive granules
Platelet and megakaryocyte
diffuse red staining and scattered red
granulation, rarely a few fine pink granules
Normoblast
rarely a few fine pink granules
Reed-Sternberg cell
negative
Sezary cell, Gaucher cell
myeloma cell and histiocyte
may be positive
Amyloid, reticulin and fibrin
may be positive
Non-specific Esterase Stain
1. 검사명 : Non-specific Esterase Stain
2. 검사원리 : 백혈구의 esterase는 naphthalene derivative를 가수분해하여naphthol compound를 내는데 이것이 diazonium salt와 결합하여 enzyme activity가 있는 부위나 혹은 그 주위에 colored precipitate를 만든다.
3. 검체 채취 용기
1) Formalin에 오염되지 않은 slides
2) EDTA 항응고제가 섞인 혈액이나 골수로 도말한 표본
4. 검체 적합성 판정 기준
1) 너무 희석된 검체로 만든 slide는 부적당하다.
2) 당일검체를 사용하며 가능하면 빛의 노출을 차단한다.
5. 시 약
i. None specific esterase stain( Sigma, USA )
1) 고정액 : Citrate solution-------------------------------------- 50ml (citrate Sol. 25ml + acetone 65ml + 37% formaldehyde 8ml)
2) 반응액
- α-naphythyl butyrate solution, (냉동보관)
- pararosaniline solution (냉장보관)
- sodium nitrite tablets (냉장보관) : DW 62.5ml + 10 tablets
- phosphate buffer (냉장보관) : DW 500ml 혼합 pH 7.7
- citrate solution (냉장보관)
3) 대조 염색액
- methylene blue solution (냉장보관)
6. 장비 : Microscope
7. 검사방법
① Phosphate buffer 40ml을 coplin jar에 넣고 37에 5분간 넣어둔다.
② 1.5ml sodium nitrite solution 1.5ml 에 pararosaniline solution 1.5ml을 ①에 첨가한다.
③ α-Naphthyl butyrate solution 5ml을 에 첨가한다.( 냉동실에서 거내 37℃ 에 prewarm 한다.)
④ 10 초간 고정액 (citrate-acetone-formaldehyde)에 고정한 후 반드시 증류수로 세척한다. (* slide를 건조시키면 안된다.)
⑤ 37℃ 에 1시간 incubation 한다.
⑥ tap water로 2-3분간 세척한다.
⑦ 5분간 methylene blue counter stain 한다.
⑧ D.W.로 세척한다.
⑨ 봉입하여 검경한다.
8. 결과 및 보고방법
1) 양성 : 단구에는 α-naphthyl acetate activity가 있으므로 양성이다. megakaryocytes, histiocytes
2) 약양성 : 비정형 림프구, 림프종의 분화가 안된 림프구
3) 음성 : 호중구 과립구의 전구 세포
Sugar Water
1. 검사명 : Sugar Water Test
2. 검사원리 : Paroxysmal noctural hemoglobinuria(발작성 야간 혈색소뇨증) 환자의 적혈구는 보체를 포함한 low ionic strength의 혈청에 노출되면 용혈되나 정상인의 적혈구는 용혈되지 않는다.
3. 환자준비 : 환자와 동일한 혈액형의 정상인을 대조로 검사한다.
4. 항 응고제 : double oxalated : whole blood = 0.5ml : 4.5ml
※ 단, EDTA blood or heparinized blood는 사용하지 말아야 한다.
5. 시 약 : 10% sugar water solution(상품화된 설탕 10g / 증류수 100ml)
6. 정도관리 물질 : 동일한 혈액형의 정상인 혈액
7. 장비 : 15ml conical centrifuge 튜브 & pipets
8. 검사방법
1) 9.5% sugar water sol. 9ml + 1ml whole blood → mix
2) 실온에서 30 분간 방치한다.
3) 원심분리(1500rpm/10min) 후 용혈여부를 육안으로 판독한다.
( 정상인의 혈액은 같은 방법, 환자의 검체를 1ml + saline9ml 로 동시에control로 한다.)
9. 결과 및 보고방법
1) 용혈이 보이면(10%이상) 양성으로 판정하고 용혈이 보이지 않으면 음성으로 판정한다.
2) 양성이면 확인검사를 위하여 Ham's test를 반드시 해야한다.
10. 검사결과의 임상적 의의 : PNH 환자의 simple screening 검사이다.
LAP Score(Leukocyte alkaline phosphatase stain)
1. 검사명 : LAP Score(Leukocyte Alkaline Phosphatase Stain)
2. 검사원리 : 기질인 Naphthol AS-BI phosphate는 알카리성 인산요소에 의해 가수분해되어 phosphate + arynaphtholamide를 형성하고 arynaphtholamide는 diazonium salt인 fast red violet salt와 결합하여 호중구내 alkaline phosphatase의 활성도에 따라 불용성인 붉은 침전물을 형성한다.
3. 환자 검체준비 : 환자가 직접 혈액학계에 내려와 손끝에서 혈액을 채혈한 후 slide smear를 3장 준비한다.
4. 검체 적합성 판정기준 : 신선한 말초혈액 도말표본을 말린 뒤 즉시 고정하며 보관 할때는 고정이 끝난 뒤 3 시간정도 말린 후 -20℃에 보관한다.
5. 정도관리 : Neutrophil이 많은 slide를 positive control로 사용한다. 특히( 임산부의 말초혈액)이 좋다.
6. 시약
1) 고정액 : citrated buffered acetone(60%) 냉장보관
(1) 0.03M sod. citrate(8.82g/L), 32ml + 0.03M citric acid 168ml
(2) acetone : 150ml
2) 0.2M propanediol stock buffer sol.(냉장보관)
(1) 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol: 10.5g
(2) DW : 500ml
3) 0.05M propanediol working sol.(pH 9.4 - 9.6)
(1) 0.2M propanediol stock buffer sol.: 250ml
(2) 0.1M HCl(conc Hcl 8.4 ml/L): 50ml
(3) DW: 1000ml 냉장보관 했다가 사용시 실온으로 !
4) 염색액
(1) Naphthol AS-BI phosphate: 5mg
(2) N.N-Dimethylformamide: 0.3ml
이때 물기가 있으면 안되고 충분히 용해되어야 염색이 된다.
(3) 0.05M propanediol working buffer sol.: 60ml
(4) Fast red violet salt LB : 30mg 반드시 여과( filteration )를 한다.
5) 대조 염색액 : Mayer hematoxylin( 1g hematoxylin /50ml DW )
a.Hematoxyline .................... 1g + D.W .................. 500ml
(Heat just to boilling, add another 500ml D.W.)
Sod. iode .............. 0.2g + Amm. Pot. sulfate ............. 50g
( Store in brown bottle at room temp. and filter before use)
b. 1% Methylene blues ............ 1g + D.W. to 100ml
7. 장비 : Microscope
8. 검사방법
1) 신선한 말초혈액이나 heparin으로 처리된 혈액으로 슬라이드를 3장씩 만든다
2) 0 - 4℃의 formalin fixative sol에 30초 , aceton fixative sol에 실온에서 30 초간 고정한다.
3) 흐르는 물에 세척하고 30-60 초간 air dry 시킨다.
4) 염색액에 슬라이드를 넣고10 분간 실온에 방치한다.
5) 흐르는 물에 1분간 세척한다.
6) 37℃에서 정확히 30분간 신선한 substrate mixture에 incubation 한다.
7) 30-60초 흐르는 물에 세척
8) 여과한 염색액(hematoxylin)으로 6 분간 대조염색한다.
9) 흐르는 물에 1-2 분간 세척한다.
10) Air dry 시킨 후 봉입하여 현미경으로 관찰한다.
9. 결과 및 보고방법 : 얇게 도말된 부분에서 neutrophil이나 band를 찾아서 100 count동안 LAP score를 계산하는데 0에서 4까지 등급을 나누어 계산한 후 총 합계를 보고하며 그 기준은 다음 표와 같다.
Table. Characteristics of Scoring Precipitated Azo Dye in Cytoplasm Score reading
Amount
Size of granules
Intensity of staining
Cytoplasm
0
none
N/A
none
none
1
one forth
small
faint to moderate
colorless to pale blue
2
one half
small
moderate
colorless to pale blue
3
three quarter
mediun to large
strong
colorless to pale blue
4
full( all )
medium and large
brilliant
not visible
10. 참고치 : 13-130
11. 검사결과의 임상적 의의
1) 증가 : polycythemia vera, a variety of malignancies, pregnancy, infections/inflammatory disorders, emotional stress, etc...
2) 감소 : paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, chronic myelogenous leukemia
Carboxyhemoglobin ( Co - Hb )
1. 검사종목 : CO-Hemoglobin
2. 검사원리 : Co 는 Hb와의 친화력이 산소의 210배나 되어 공기중에 Co가 있으면 쉽게 체내에서 Co-Hb로 된다.
3.검체채취용기 : double oxalate (혈액학계에서 직접 tube를 타가도록 한다.)
Blood 4.5 ml+Double dxalate 500ul
4. 시 약 : 40% NaOH (2.5N NaOH)
: 2.5N NaOH ------- 1N (40g/l) ------> 2.5N = 100G/l
: 40% NaOH -------- ( 40g/100ml) -----> 40% NaOH
5. 정도관리 : 정상인 대조검사
6. 검사방법 : Tantative Rapid Test ( NaOH Test )
1). D.W 10ml에 Double Oxalated Blood 100ul를 넣어 잘 Mix한다.
( Hb 농도가 비슷한 것으로 Control를 세운다 )
2). 40% NaOH(2.5N NaOH)를 몇방울 떨어 뜨리면 Oxyhemoglobin은 암갈색, Co-Hb는 적색(선홍색)을 나타내므로 back groud를 흰색배경으로 하여 눈으로 확인한다.
7. 계산결과 및 보고방법 : Positive (양성), Negative (음성)으로 보고한다.
8. 검사결과에 영향을 미칠 수 있는 사항 : Hemolysis된 검체는 절대 안된다.
9. 검사결과 : 연탄가스 중독시 적색 (선홍색) ---positive
Prothrombin Time
1. 검사명 : Prothrombin Time & Fibrinogen
2. 검사원리 : 검체속에 있는 혈액 응고 인자와 시약을 혼합하여, 혈액응고기전에서 피브리노겐(fibrinogen) 이 피브린(fibrin)으로 전환될 때에 다양한 강도를 가진 램프에서 방출되는 빛 (405nm, 550nm)을 검체에 투과시킬 때, 검체가 응고될때에 통과되는 빛을 광 감지기가 감지하여 전자신호를 이용하여 응고형성을 감지하게 된다.
이때 응고가 시작될때의 light scatter 강도의 증가는 PT 와 관련이 있다.
3. 검체 준비
1) 3.2% sodium citrate 0.3ml이 들어있는 튜브에 전혈 2.7ml
* Hct에 따른 항응고제 비율
6%일때 1 : 5 45%일때 1 : 9
20%일때 1 : 6 55%일때 1 : 11
30%일때 1 : 6 63%일때 1 : 13
2) 채혈 즉시 응고가 일어나지 않도록 10 회정도 혼합한다.
3) 원심방법 : 3000 rpm 에서 10 분
4) 보관방법 : Factor V는 파괴되기 쉬우므로 채취후 가능한한 빨리 혈장 분리하여 실온 보관시 2시간, 냉장온도는 4 시간이내 검사를 실시하여야 하며 -20℃에서는 2 주간, -70℃ 에서는 6 개월간 보관 가능하며, 검체의 해동시에는 37℃에서 재빨리 녹여 즉시 검사 를 실시한다.
4. 검체 부적합성 판정 기준
1) 용혈된 검체
2) 지방성인 검체(lipemic sample)
3) 항응고제(anticoagulant) 비율이 맞지 않는 검체
(항응고제 : 혈액 = 1 : 9 ----- Hct이 45%일 때)
4) 응고가 일어난 검체(부분적 응고라도 부적합)
5) 헤파린이 섞인 검체
6) 검체 채취후 너무 오래 경과한 경우
7) 혈소판 풍부 혈장을 사용했을때
5. 시약
1) thromboplastin-DS : 증류수 4ml로 희석하여 미리 준비 한다.
2) Control plasma : 증류수 1ml로 희석하여 15분후 약하게 mix하여 사용한다.
(유효기간인 것을 확인하며 검사직전 시약을 확인한다.)
6. 정도 관리 물질
1) Normal control plasma(day & night shift)
2) Abnormal control plasma (day & night shift)
3) Pool plasma
* 정도 관리 측정치 허용범위
검사실 자체의 허용범위를 설정하고 reagent lot가 바뀌거나 장비에 변경사항이 있을 경우 다시 설정한다. 항상 측정치는 기록하고 이미 설정된 허용범위와 비교한다. 허용범위를 벗어나는 경우 우선 정도관리물질의 유효기간을 확인하고 장비점검을 마친 후에 재검사를 실시한다. 재검후에도 허용범위안에 들지 않으면 계장에게 보고하여 장비를 재점검하고 문제를 해결할 수 있도록 하며 문제발견시 A/S를 받도록 한다.
자체의 허용범위를 설정하기 전에는 제조회사에서 제시한 다음 범위를 참고한다.
제조원: Ortho Diagnostic Systems Inc
상품명: Ortho Plasma Cagulation Control Level I, Level II
설정장비: semiautomated optical density end-point detector
Mean
Range
Replicate
Vial-to-vial
Lot-to-lot
Level I
12.7
± 0.2
± 0.14
± 0.25
Level II
31.7
± 0.64
± 0.48
± 0.40
7. 장비 : ELECTRA 1400C (MLA)
8. 검사방법
1) Catch bin 의 부착상태, Tray cover 의 정확한 닫힘을 확인한다.
2) cuvettes 과 wash pump의 양을 확인, 보충시킨다.
3) 전원을 켠다. 6분5초후 ESC를 1번 누르면 MAIN MENU 상태가 된다.
4)시약을 장착시킨다.
( CaCl2 - pump 2, PT - pump 3, PTT - pump 4 )
5) sample을 Tray에 배역시키고 cover는 열어서 tray를 좌우로 돌려서 덜컥 소리가 나도록 고정시킨 다.
6) patient list를 작성한다.
7) 시약을 prime 시킨다.
8) RUN 시킨다.
9) 검사가 끝나면 patients results management에서 해당 file을 전송시킨다.
10) PC에서 특수혈액검사 program을 열어서 전송된 결과를 확인한 후 결과를 출력시킨다.
11) 장시간 MLA를 사용치 않을 경우 시약을 분리해서 냉장고에 보관후 전원을 OFF 시킨다.
9. 결과 및 보고방법
PT① sec (초 : 소수점 이하 첫자리까지)와 INR 값을 보고한다.
② 비 정상적인 결과가 나오면 반복 검사후 결과를 확인한다
③ panic value가 나오면 결과를 누적조회하여 바꾸어 반복 검사후 보고한다.
10. 참고치 PT : 11∼14sec
11. 검사결과의 임상적 의의
(1) 외인계응고기전의 VII, X, V, II, I 응고인자의 유전적 결핍, 간질환, Vit.K 부족으로 인하여 PT가 연장된다.
(2) 혈전증 치료를 위한 경구용 항응고제 사용시 이중 VII 인자는 외인계 응고인자중 가장 먼저 영향 을 받는다.
12. 검사 결과에 영향을 미칠 수 있는 요인
1) 2 시간 이내에 검사하여야 한다.
2) 혈장을 미리 가온하는 시간을 초과하지 않도록 한다(37℃에서 시행).
3) 섬유소원의 농도가 100mg/dl 이하시
4) 헤파린이 포함된 검체
5) 항 응고제의 비율이 잘못된 경우
13. Panic value : PT값이 26 초 이상이면 반복검사 실시후 주치의나 의뢰부서에 전화로 알려주고 확인한다.
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