꽃차의 자연치유적 활용에 관한 연구
3.실험재료 및 방법
1)실험재료
(1)재료
본 실험에 사용한 메리골드꽃은 강원도 횡성 해발 360미터 산지에서 자연 재배하여 2021년 7월2일에 채취한 것을 시료로 사용하였다.
(2)시약
Folin-Ciocalteau's phenol reagent, Na2CO3, Potassium ferricyanide, Tannic acid Ferric chloride, TCA, DPPH, ABTS, DMEM, BCS, CCK-8, Gallic acid, DMSO
(3)시료용액 제조
메리골드꽃 및 발효메리골드꽃 추출물을 10% DMSO를 이용하여 10mg/mL 농도로 희석 후 사용하였다.
2)실험방법
(1)추출 및 동결건조 방법
시료를 분쇄기(Daesung Artlon, DA280-S, Paju, Korea)로 80mesh 크기로 분쇄하여 분말형태 50g에 증류수(1L)를 넣고 100℃에서 6시간 추출하였다. 추출한 시료를 원심분리(HANIL, SUPRA22K, Daejeon, Korea)로 4,500rpm으로 15분간 원심 분리한 다음 상층액을 감압여과 한 후 48시간 동결건조(Ilshin, Korea)하여 분석 시료로 사용하였다.
(2)발효 방법
재료를 인큐베이터에 넣고 9시간 발효를 하였다. 약 70%로 건조된 재료를 다시 보자기에 싼 후 45℃의 황토방에서 48시간 2차 발효하였다.
(3)꽃차 덖는 방법
덖음솥의 온도는 60℃, 80℃, 120℃, 180℃, 200℃와 220℃의 6구간으로 설정하고 90초간 덖은 다음 실온으로 냉각시킨다. 수분함량이 3〜4%가 될 때까지 이러한 과정을 반복 실시하여 메리골드꽃차의 음료 시료로 하였다.
(4)꽃차의 우림물 제조
덖음솥의 각각의 온도에서 덖은 꽃차 1g을 물 온도 80℃, 90℃, 100℃에서 70ml를 가하여 각 온도별로 2분간 추출하여 우림물을 제조한 다음 우림물의 맛, 색과 pH에 대한 관능평가를 하였다.
(5)관능평가 방법
메리골드꽃차의 온도변화에 따른 덖음차의 우림물에 대한 관능평가방법은 아래와 같다.
관능평가는 차를 자주 음용하는 일반인 5명의 전문패널을 선발하여 3회이상의 훈련을 거친 후 평가하였으며, 평가 항목은 색, 맛, pH이다. 이 항목에 대한 관능평가 기준은 1〜10까지 범위로 설정하였다. 이 설정 범위는 가장 낮은 농도(최저값)를 1로 시작해서 가장 높은 농도(최고값)를 10으로 설정하고 숫자가 올라갈수록 농도가 증가된다.
(6)메리골드꽃과 발효메리골드꽃의 항산화 활성측정
가.총 폴리페놀 함량 측정
총 폴리페놀 함량 분석은 Folin-Denis법을 이용하였으며, 시료의 페놀성 화합물에 의해 Folin-Ciocalteu 시약이 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색되는 원리를 이용하여 분석하였다. 추출물 150㎕에 Folin & Ciocalteu's phenol reagent(Sigma-Aldrich)를 150㎕ 첨가한 후 3분간 반응하고 10%(v/v) 탄산나트륨 수용액(Sigma-Aldrich)를 150㎕ 첨가하였다. 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 SpectraMax M5 plate reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 760nm에서 흡광도를 측정하였다.) standard curve는 gallic acid(Sigma-Aldrich)를 0〜500㎕/ml의 농도로 조제하여 작성하였다.
나.총 폴리페놀 표준 검량선
메리골드꽃 추출물에 함유된 총 폴리페놀 함량은 표준물질인 Gallic acid(0〜100μg/mL)의 농도로 제조하고 시료도 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준검량선에 sample의 흡광도 값(Y 축)을 대입하여 sample내의 폴리페놀 함량(X 축)을 결정하였다. 표준물질 농도를 X 축, 피크 면적을 Y축으로 하여 검량선을 작성하였으며, 각각의 폴리페놀 성분에 대하여 작성된 검량선식을 직선을 나타내는 상관계수(R²)값이 0.9993으로 높은 직선성을 나타내어 표준곡선으로 사용하였다.(Figure 10)
다.DPPH radical 소거능 측정
DPPH radical은 매우 안정한 활성산소종(ROS)으로 항산화 활성이 있는 물질과 만나면 전자를 내어주어서 radical이 소멸되고 색깔이 변하는 특성이 있다.
DPPH assay는 free radical에 대한 시료의 항산화 활성을 평가하기 위한 것으로 본 실험은 Sharma, O. P.(2009)의 방법을 인용하였다. DPPH radical 소거능 측정은 96 well plate에 시료 50㎕와 DPPH 용액 100㎕을 가한 후 35℃ 암실에서 30분간 반응시키고 SpectraMax M5 plate reader (Molecular Devices, USA)를 사용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다(Sharma, O. P.2009) 표준물질로는 AA와 BHA를 사용하였다. DPPHradical 능은 아래의 식을 이용하여 계산하였다.
Radical scavenging activity(%)=[1-(Abs sample / Abs blank)] × 100
라.ABTS radical 소거능 측정
ABTS 라디칼 소거능은 산화환원 반응에서 산화반응을 이용한 방법으로 청록색인 고유색이 변화하는 Roberta R, et al.,(1999)의 방법3을 인용변형하여 비색법으로 측정하였다. ABTS 7mM과 potassium persulfate 2.45mM 용액을 제조 후 동일 비율로 혼합하고 ABTS radical 양이온(ABTS·+)생성물을 위해 24시간 동안 암소에서 반응시켰다. 그 후에 ABTS+ 용액을 0.7∼1.0 ± 0.02의 흡광도가 나타날 때까지 734nm에서 에탄올로 희석하였다. 그 후, ABTS 50㎕와 농도 별로 희석한 시료 100㎕를 넣고 암실에서 30분 동안 37℃에서 반응시킨 후 734nm에서 흡광도를 측정하였다. 다음의 식을 이용하여 ABTS 라디칼 소거능(%)을 산출하였다.
표준물질로는 AA와 BHA를 이용하였다.
ABTS radical scavenging activity (%) = [1-(Abs sample / Abs blank)] × 100
마.Reducing power 측정
환원력의 측정은 potassium ferricyanide reduction method를 사용하여 환원물질이 수소원자를 공여함으로써 불안정한 free radical사슬을 분해하고 반응을 시작하게 되는 것으로 peroxide의 전구물질과 미리 반응함으로써 peroxide 형성을 억제한다.
환원력 측정은 시료 150㎕에 1% potassium ferricyanide 150㎕을 혼합한 후 50℃에서 20분간 반응시켰다(Oyaizu, M. 1986). 반응액에 10% trichloroacetic acid 150㎕를 첨가하여 10분 동안 5,000rpm에서 원심분리한 후 상층액 150㎕에 증류수 150㎕와 0.1% ferric chloride 15㎕를 가하여 혼합하였다.
그 후 반응액 150㎕를 96well plate에 가하고, SpectraMax M5 plate reader (Molecular Devices, USA)를 이용하여 700nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조구로 50〜400㎕/ml AA와 BHA를 사용하였다.
(7)암 세포의 배양 및 실험방법
가.세포배양
NIH3T3 cell, HeLa cell과 HCT116 cell은 American Type Culture Collection(ATCC, MD, USA)에서 분양받았으며, 10% fetal bovine serum(HyClone Laboratories Inc, UT, USA)과 1% antibiotics가 포함된 RPMI media(HyClone LaboratrisInc.)를 사용하여 5% CO2, 37°C 조건에서 배양하였다.
나.세포생존율
96-well plate의 각 well당 세포를 1 × 105 cells씩 넣고, 37°C, 5% CO2 배양기에서 16시간 배양하였다. 보관되어 있던 시료를 처리 전에 증류수로 50, 100 및 200μg/ml 농도가 되도록 희석하였다. 각 well당 2㎕씩 배지 내에 첨가하고 48시간이 경과한 후에 CCK-8를 10㎕씩 넣고 37°C에서 3시간 동안 반응시켰다. 이 반응물을 SpectraMax M5 plate reader (Molecular Devices, USA)를 사용하여 480nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.
세포생존율은 다음 식에 따라 계산하였다.
Cell viability (%) = (시료 처치군의 흡광도 / 대조군의 흡광도) × 100
(8)통계처리
모든 실험 결과는 Statistical Package for the social science(SPSS) 통계 프로그램을 이용하여 평균(mean)±표준편차(S.D.)로 나타냈다. 각 실험군의 분석 항목별 통계의 유의성은 Duncan's multiple range test를 이용하여 p<0.05 수준에서 검증하였다.
<꽃차의 자연치유적 활용에 관한 연구/송진화 선문대학교 일반대학원 통합의학과 자연치유전공 박사학위논문>