http://cpl.yonsei.ac.kr/text5-1.htm
2) 시약
그람염색 시약은 상품화된 것을 사용하거나 검사실에서 만들어 쓸 수 있다. 모든 시약은 만든 날짜와 유효 기간을 시약 용기에 붙이거나 시약 대장에 기록한다. 많은 양의 시약이 사용될 때는 염색 성분의 저장 용액 (stock solution)을 만든 후 필요할 때마다 나누어 사용하면 시약 성분을 일관성있게 유지할 수 있고 사용도 편리하다. 또한 저장 용액량도 필요에 따라 증감하여 만든다. 염색 시약의 저장 용액은 나사마개가 달린 갈색병에 보관하고 사용액 (working solution)을 플라스틱 병에 넣어 사용할 때는 2주마다 새로 갈아주어야 한다. 제조 시약은 순도가 높은 시약 등급 제품을 사용해야 한다.
그림 5-1. 그람양성세균 (왼쪽)과 그람음성세균 (오른쪽)의 세포벽 구조
(1) Hucker 변법
① Crystal violet
A. Crystal violet 저장용액
Crystal violet (90-95%)
Ethanol
40
400
g
mL
B. Ammonium oxalate 저장용액 (1%)
Ammonium oxalate
증류수
16
1,600
g
mL
유리그릇에서 잘 섞은 다음 실온에서 보관하면 A와 B용액은 1년동안 사용할 수 있다. Ethanol은
가연성 물질이므로 조심해서 다루어야 한다.
C. Crystal violet 사용액
Crystal violet 저장 용액
Ammonium oxalate 저장 용액 (1%)
40
160
mL
mL
유리그릇에 Crystal violet 저장 용액을 여과지로 완전히 여과시킨 후 ammonium oxalate 저장
용액을 여과시킨 다음 두 저장 용액의 유효기간 중 최근 날짜를 기록하여 병에 붙인다.
② Gram iodine
A. Lugol iodine 저장 용액
Iodine crystals
Potassium iodide
증류수
25
50
500
g
g
mL
갈색병에 넣고 용해될 때까지 잘 섞은 후 실온에 보관한다. 또는 iodine과 potassium iodide를
유발에 넣고 증류수 3-4 mL씩 넣으면서 갈은 후 완전히 녹은 뒤에 남은 증류수로 헹구어서
갈색병에 넣는다. 제조한 날로부터 6개월간 사용할 수 있다.
B. Sodium bicarbonate (NaHCO3)
Sodium bicarbonate (NaHCO3)
증류수
50
1,000
g
mL
유리그릇에서 잘 섞은 다음 실온에서 보관하면 1년 동안 사용할 수 있다.
C. Gram iodine 사용액
Lugol iodine 저장 용액
Sodium bicarbonate (NaHCO3) 5%
증류수
60
60
220
mL
mL
mL
갈색병에서 잘 섞은 후 실온에 보관한다. 6개월간 사용할 수 있다. Iodine과 potassium iodide는
부식성이 있으므로 흡인과 피부접촉을 피해야 하며 실수로 마시는 일이 없어야 한다.
③ 탈색제
탈색제는 종류에 따라 95% ethanol의 탈색 속도가 가장 느리고 acetone이 가장 빠르며 95%
ethanol과 acetone을 1:1의 비율로 혼합한 용액이 일관성 있는 결과를 주므로 가장 흔히 사용한다.
95% ethanol은 학생이나 비숙련자의 교육용으로 적합하며 acetone은 재현성이 낮으므로 숙련
자만 사용이 가능하다. Ethanol과 acetone 모두 가연성 물질이므로 화기가 없는 상태에서 두
용액을 혼합해야 한다.
④ 대조염색
A. Safranin
ⓐ Safranin 저장 용액
Safranin O
Ethanol, 95%
5.0
200
g
mL
유리그릇에서 잘 섞은 후 실온에서 보관하면 1년 동안 사용할 수 있다.
ⓑ Safranin O 사용액
Safranin O 저장 용액
증류수
20
180
mL
mL
유리그릇에서 잘 섞은 후 실온에서 보관하면 1년 동안 사용할 수 있다.
B. Basic fuchsin, 0.1 또는 0.2% (wt/vol)
Basic fuchsin
증류수
0.1 또는 0.2
100
g
mL
갈색병에 basic fuchsin을 넣은 후 천천히 증류수를 넣은 다음 완전히 녹을 때까지 잘 섞는다.
실온에 보관하면 1년간 사용할 수 있다.
(2) Carbol-fuchsin 대조염색
Hucker 변법과 유사하나 탈색 방법과 대조염색 방법이 다르다. 탈색제는 95% ethanol을 사용하며 대조염색 시약은 carbol-fuchsin 또는 0.8% basic fuchsin을 사용한다.
① Carbol-fuchsin 대조염색액
A. 용액 A
Basic fuchsin
Ethanol, 95%
0.3
10
g
mL
Basic fuchsin과 ethanol을 갈색병에 넣고 용해시킨다.
B. 용액 B
Phenol 결정 녹인 것
증류수
5
95
mL
mL
플라스크에 증류수를 넣고 phenol 결정 녹인 용액을 첨가한다. 용액 A에 용액 B를 넣은 후
실온에 보관하면 1년간 사용할 수 있다.
② 0.8% basic fuchsin 대조염색액
Basic fuchsin
증류수
0.8
100
g
mL
Basic fuchsin을 갈색병에 넣고 basic fuchsin이 완전히 용해되도록 증류수를 조금씩 첨가하면서
잘 섞는다. 실온에 보관하면 1년간 사용할 수 있다.
(3) 혐기성 세균을 위한 Kopeloff 변법
① Alkaline crystal violet
A. 용액 A
Crystal violet (90-95%)
증류수
10
1,000
g
mL
유리그릇에서 잘 섞은 다음 실온에서 보관하면 1년 동안 사용할 수 있다.
B. 용액 B: Sodium bicarbonate (NaHCO3)
Sodium bicarbonate(NaHCO3)
증류수
50
1,000
g
mL
② Kopeloff iodine
Sodium hydroxide (NaOH)
증류수
Iodine crystal
Potassium iodide
증류수
4
25
20
1
975
g
mL
g
g
mL
NaOH를 25 mL의 증류수로 녹여 갈색병에 넣고 iodine crystal과 potassium iodide를 첨가한
다음 잘 섞은 후 975 mL 증류수를 조금씩 첨가하면서 잘 섞는다.
③ 탈색제
Ethanol, 95%
Acetone
700
300
mL
mL
갈색병에서 잘 섞은 후 실온에 보관하면 1년간 사용할 수 있다.
④ 대조염색 (Kopeloff safranin)
Safranin O
Ethanol, 95%
증류수
20
100
1,000
g
mL
mL
1,000 mL 유리병에 safranin O를 충분히 녹일 수 있는 양 (보통 50 mL가 필요함)만 첨가한 후
증류수 1,000 mL를 넣은 다음 실온에 보관하면 1년간 사용할 수 있다.
도말작업부터는
3) 정도관리
(1) 육안으로 매일 관찰할 사항
① Crystal violet 침전물이 있을 때에는 여과하여 침전물을 제거한 후 사용해야 한다.
② 시약 용액이 증발되면 좋은 염색 결과를 얻을 수 없으므로 사용액은 일정기간마다 교체하여 사용
해야 한다.
(2) 시약이 바뀔 때나 하루에 한번 Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus epidermidis (ATCC
12228) 또는 S. aureus (ATCC 25923) 균주로 그람염색하여 정도관리를 시행하여 E. coli는 분홍색,
S. aureus은 짙은 보라색을 확인한다.
(3) 그람염색의 판독이 어렵거나 염색 결과가 부정확할 때는 원인을 찾아내어 해결해야한다. 그람양성세균이
흐리게 염색되거나 그람음성간균에 crystal violet가 묻어 있을 때 또는 도말 표본의 가장자리에만
염색이 됐을 때는 검체의 도말 제작, 염색 시약 및 염색 과정에 문제가 있을 때 발생한다.
다음은 질이 나쁜 염색결과의 흔한 원인들이다.
① 재생 슬라이드를 깨끗이 닦지 않고 사용하거나 새 슬라이드에 묻어 있는 기름기를 제거하지 않고
염색을 시행했을 때
② 검체를 너무 두껍게 도말했을 때
③ 슬라이드를 과열하여 고정했을 때
④ 염색 과정 중에 세척을 오래하거나 강하게 했을 때
(4) 그람염색의 결과 보고를 다시 확인하는 체계를 구축하여 그람염색 판독의 정확성을 유지한다.
① 책임자 또는 부서장은 매일 그람염색 표본을 추출한 후 결과를 확인하는 작업을 시행하여 검사자
교육의 필요성을 결정하거나 임상적 연관성에 대한 조언을 주는데 도움을 줄 수 있다.
② 최종 배양 결과와 그람염색 결과를 비교한다. 그람염색에서 관찰된 균 형태는 배양에서도 분리
되어야 하며 그람염색에서 보고되지 않은 균종이 분리되면 염색과 배양 결과를 다시 확인해야
한다. 그러나 그람염색에서 관찰되지 않아도 배양에서는 분리될 수 있다.
③ 참고가 되는 표준 슬라이드는 직원의 교육과 결과 비교에 매우 중요하다.
4) 도말
(1) 도말 표본 제작의 기본적인 원칙
좋은 도말 표본은 균종이 조밀하여 쉽게 관찰할 수 있으며 균종의 배열형태를 확인할 수 있을 정도의 단일막 두께로 제작해야 한다. 깨끗한 새 슬라이드 [(25 X 75 mm (1 X 3 inch)]를 알코올이 담져진 용기에 보관한 후 사용 전에 꺼내어 공기 중에 말리거나 가열한 다음 사용하면 가장 좋은 결과를 얻을 수 있다. 슬라이드 한쪽 끝이 반투명 유리로 제작된 것은 작업번호의 기입과 조작에 편리하다. 도말 표본 제작을 위하여 검체를 다룰 때에는 라텍스 장갑과 일반적인 주의사항에 맞는 보호장비를 착용해야 한다.
(2) 임상 검체별 도말 표본 제작
① 면봉
A. 세포 성분과 균배열 형태가 파괴되지 않도록 면봉을 부드럽게 슬라이드 위에 돌려가면서 도말
한다.
B. 1개의 면봉으로 도말과 배양을 동시에 검사할 경우에는 면봉을 식염수가 들어 있는 멸균 관에
넣고 진탕기로 잘 푼 다음 면봉을 관의 벽에 대고 짜낸 검체로 도말 표본을 제작하고 남은 검체
는 접종에 사용한다.
② 흡인액, 삼출물, 객담, 대변 등과 같은 면봉이외의 검체
A. 시린지로 채취한 검체는 먼저 멸균 관에 옮긴다. 필요에 따라 진탕기를 사용할 수도 있다.
B. 대가지, 피펫, 백금이 등으로 농성이 심하거나 혈액이 묻어 있는 부위를 취하여 슬라이드 위에
놓은 후 새 슬라이드를 덮은 다음 위아래의 슬라이드를 서로 반대방향으로 당겨 얇은 도말
표본을 만든다. 슬라이드 옆으로 검체가 흐르면 소독제를 적신 일회용 종이 타월로 닦는다.
너무 두껍거나 농성이 심하여 얇은 도말 표본제작이 어려울 때는 식염수 몇 방울을 슬라이드에
떨어뜨린 후 도말하면 된다. 이러한 모든 검사과정은 안전상자 안에서 작업해야 한다.
③ 뇌척수액과 체액
A. 세포원심기를 이용한 방법
세포원심기 (cytospin slide centrifuge)는 그람염색의 예민도를 증가시키며 원심분리와 검사에
소요되는 시간이 감소되므로 보다 신속한 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다.
B. 원심분리법
피펫으로 침전물이 0.5 mL 정도 남게 상청액을 제거한 후 상청액은 멸균 관에 담고 침전물은
진탕하거나 Pasteur 피펫으로 빨기와 뿜기를 몇 번하여 섞은 다음 Pasteur 피펫으로 침전물
한 방울을 슬라이드 위에 떨어뜨린 후 공기 중에서 말린다. 주의할 점은 침전물을 펼쳐서 도말
하면 안되며 세균 관찰을 쉽게 하기 위해 검체 농도를 농축하려면 처음 위치에 침전물 한 방울
을 다시 떨어뜨려 겹치게 한다.
④ 요
요 검체는 원심분리하지 않고 잘 섞은 후 Pasteur 피펫으로 한 방울을 슬라이드에 떨어뜨린 다음
공기 중에서 말리며 펼쳐서 도말하면 안된다.
⑤ 마른 검체 또는 양이 적은 검체
멸균 식염수 0.5 mL로 검체를 유화 시킨 후 Pasteur 피펫으로 한 방울을 슬라이드에 떨어뜨린 다음
피펫 끝으로 검체를 펼쳐 면이 고른 얇은 도말을 만든다.
⑥ 생검과 조직
터치 도말로 표본을 만들거나 조직을 균질화 시킨 후 표본을 만들 수 있다. 도말 제작 전에 조직을
균질화하면 종종 세포의 특징적인 모양과 배열형태를 관찰할 수 없다. 터치 도말 표본은 검체를
페트리 접시 위에 놓고 수술용 칼로 조직을 잘게 썲은 후 조각난 검체를 집게로 잡아 슬라이드 위에
문지른다. 조직의 균질화 후에 얻은 검체는 피펫으로 한 방울을 취하여 슬라이드에 떨어뜨린 다음
슬라이드의 1/4정도 넓이로 펼친다.
(3) 액체배지로 도말 표본을 제작하는 방법
액체배양배지의 도말은 한 개의 슬라이드에 여러 배지를 도말하면 염색과정 중에 한쪽이 다른 쪽으로 씻겨 내려갈 수 있으므로 한 개의 슬라이드에 한 개의 도말 표본을 만드는 것이 좋다. 도말 방법은 Past-
eur 피펫으로 배지 한두 방울을 슬라이드에 떨어뜨린 후 얇게 펼친다. 혈액 배양용 배지에 부착된 통기바늘을 이용하면 조작 과정 중에 발생할 수 있는 오염 가능성을 줄일 수 있다.
(4) 고체배지의 집락으로 도말 표본을 제작하는 방법
증류수는 세포벽이 약한 균종의 형태를 변형시킬 수 있으므로 멸균 식염수나 물 한 방울을 슬라이드 위에 떨어뜨린 후 댓가지나 백금이로 집락의 일부분을 취하여 식염수와 부드럽게 섞어 에어로졸이 생기지 않도록 한다. 도말액은 약간 흐리고 균질하도록 식염수 양, 도말 범위, 접종 균량 등을 맞춘다. 접종량이 너무 많거나 식염수 양이 적을 때 또는 도말 범위를 너무 좁게 펼치면 도말을 말린 후 마른 자국이 여러 개 보인다.
5) 도말 고정
(1) 가열법
가열법은 도말 표본을 공기 중에서 말린 후 불꽃에 두세 번 통과시키거나 슬라이드를 소형소각기 (microincinerator) 앞에 5-10초간 갖다 댄다. 또는 도말 표본을 60℃ 전기발열판에 놓고 말린다. 두 방법 모두 세포 성분이 변형되지 않으려면 과열을 피해야 하며 슬라이드를 식힌 후 염색한다.
(2) 메탄올 고정법
이 방법은 적혈구의 용혈이 없으므로 슬라이드의 배경이 깨끗하며 요 검체가 씻겨져 나가는 것을 방지하는 장점이 있다. 고정방법은 슬라이드를 공기 중에서 말린 후 메탄올 몇 방울을 슬라이드에 떨어뜨려 1분 동안 고정한 다음 슬라이드를 세워 남아있는 메타놀이 흘러내리면 다시 공기 중에 말린다. 이 때 물로 세척하거나 가열하면 안된다.
6) 염색 과정
(1) Hucker 변법
① 고정한 도말 표본 위에 crystal violet를 넘칠 정도로 부은 후 30초간 염색한 다음 crystal violet를
흘려 버린다.
② 슬라이드 뒷면 모서리에 수돗물을 조금씩 흘려서 씻는다. 수돗물을 너무 세게 틀면 도말한 검체가
떨어져 나갈 수 있으며 세척 시간이 길면 그람양성세균에 붙어있던 crystal violet가 씻겨 나갈 수
있으므로 조심해야 한다. 흐르는 물통에서 슬라이드를 세척할 때는 보통 5초간 담근 후 꺼낸다.
③ Iodine 용액으로 슬라이드에 묻은 물을 세척한 후 신선한 iodine 사용액을 슬라이드 위에 넘칠 정도
로 부은 후 30초 동안 염색한 다음 수돗물을 조금씩 흘려서 씻는다.
④ 슬라이드를 비스듬한 채로 탈색제를 부어 자색 물이 더 이상 안 나오면 중단한다. 탈색 시간은
도말의 두께와 탈색제 종류에 따라 조정해야 한다.
⑤ 약하게 흐르는 물로 씻고 safranin을 슬라이드 위에 넘칠 정도로 부은 후 30초 동안 대조염색한
다음 흐르는 물로 씻는다.
⑥ 슬라이드를 세워서 공기 중에 말리거나 슬라이드 자동 건조기를 이용한다.
⑦ 저배율로 도말 표본을 검경하여 균과 세포 분포 및 염색 시약이 뭉쳐있는지를 확인한 후 뭉쳐있는
염색 시약이 많을 때에는 도말 표본을 새로 만든 후 crystal violet를 재여과한 시약으로 다시 염색
한다.
* Carbol-fuchsin 대조염색법은 Hucker 변법과 유사하나 탈색제로 95% ethanol을 사용한 후
carbol-fuchsin 또는 0.8% basic fuchsin으로 염색하는 것이 다르다 (표 5-1).
(2) Kopeloff 변법
① 고정한 도말 표본 위에 alkaline crystal violet 용액을 넘칠 정도로 부은 후 NaHCO3 사용액
다섯 방울을 첨가한 다음 2-3분간 나둔다.
② Kopeloff iodine으로 씻은 후 다시 Kopeloff iodine을 얹고 2분 이상 염색한다.
③ 슬라이드를 비스듬히 들은 채로 탈색제를 부은 후 즉시 세척한다.
④ Kopeloff safranin으로 30초 이상 대조염색한 후 수돗물을 조금씩 흘려서 씻은 다음 말린다
2) 시약
그람염색 시약은 상품화된 것을 사용하거나 검사실에서 만들어 쓸 수 있다. 모든 시약은 만든 날짜와 유효 기간을 시약 용기에 붙이거나 시약 대장에 기록한다. 많은 양의 시약이 사용될 때는 염색 성분의 저장 용액 (stock solution)을 만든 후 필요할 때마다 나누어 사용하면 시약 성분을 일관성있게 유지할 수 있고 사용도 편리하다. 또한 저장 용액량도 필요에 따라 증감하여 만든다. 염색 시약의 저장 용액은 나사마개가 달린 갈색병에 보관하고 사용액 (working solution)을 플라스틱 병에 넣어 사용할 때는 2주마다 새로 갈아주어야 한다. 제조 시약은 순도가 높은 시약 등급 제품을 사용해야 한다.
그림 5-1. 그람양성세균 (왼쪽)과 그람음성세균 (오른쪽)의 세포벽 구조
(1) Hucker 변법
① Crystal violet
A. Crystal violet 저장용액
Crystal violet (90-95%)
Ethanol
40
400
g
mL
B. Ammonium oxalate 저장용액 (1%)
Ammonium oxalate
증류수
16
1,600
g
mL
유리그릇에서 잘 섞은 다음 실온에서 보관하면 A와 B용액은 1년동안 사용할 수 있다. Ethanol은
가연성 물질이므로 조심해서 다루어야 한다.
C. Crystal violet 사용액
Crystal violet 저장 용액
Ammonium oxalate 저장 용액 (1%)
40
160
mL
mL
유리그릇에 Crystal violet 저장 용액을 여과지로 완전히 여과시킨 후 ammonium oxalate 저장
용액을 여과시킨 다음 두 저장 용액의 유효기간 중 최근 날짜를 기록하여 병에 붙인다.
② Gram iodine
A. Lugol iodine 저장 용액
Iodine crystals
Potassium iodide
증류수
25
50
500
g
g
mL
갈색병에 넣고 용해될 때까지 잘 섞은 후 실온에 보관한다. 또는 iodine과 potassium iodide를
유발에 넣고 증류수 3-4 mL씩 넣으면서 갈은 후 완전히 녹은 뒤에 남은 증류수로 헹구어서
갈색병에 넣는다. 제조한 날로부터 6개월간 사용할 수 있다.
B. Sodium bicarbonate (NaHCO3)
Sodium bicarbonate (NaHCO3)
증류수
50
1,000
g
mL
유리그릇에서 잘 섞은 다음 실온에서 보관하면 1년 동안 사용할 수 있다.
C. Gram iodine 사용액
Lugol iodine 저장 용액
Sodium bicarbonate (NaHCO3) 5%
증류수
60
60
220
mL
mL
mL
갈색병에서 잘 섞은 후 실온에 보관한다. 6개월간 사용할 수 있다. Iodine과 potassium iodide는
부식성이 있으므로 흡인과 피부접촉을 피해야 하며 실수로 마시는 일이 없어야 한다.
③ 탈색제
탈색제는 종류에 따라 95% ethanol의 탈색 속도가 가장 느리고 acetone이 가장 빠르며 95%
ethanol과 acetone을 1:1의 비율로 혼합한 용액이 일관성 있는 결과를 주므로 가장 흔히 사용한다.
95% ethanol은 학생이나 비숙련자의 교육용으로 적합하며 acetone은 재현성이 낮으므로 숙련
자만 사용이 가능하다. Ethanol과 acetone 모두 가연성 물질이므로 화기가 없는 상태에서 두
용액을 혼합해야 한다.
④ 대조염색
A. Safranin
ⓐ Safranin 저장 용액
Safranin O
Ethanol, 95%
5.0
200
g
mL
유리그릇에서 잘 섞은 후 실온에서 보관하면 1년 동안 사용할 수 있다.
ⓑ Safranin O 사용액
Safranin O 저장 용액
증류수
20
180
mL
mL
유리그릇에서 잘 섞은 후 실온에서 보관하면 1년 동안 사용할 수 있다.
B. Basic fuchsin, 0.1 또는 0.2% (wt/vol)
Basic fuchsin
증류수
0.1 또는 0.2
100
g
mL
갈색병에 basic fuchsin을 넣은 후 천천히 증류수를 넣은 다음 완전히 녹을 때까지 잘 섞는다.
실온에 보관하면 1년간 사용할 수 있다.
(2) Carbol-fuchsin 대조염색
Hucker 변법과 유사하나 탈색 방법과 대조염색 방법이 다르다. 탈색제는 95% ethanol을 사용하며 대조염색 시약은 carbol-fuchsin 또는 0.8% basic fuchsin을 사용한다.
① Carbol-fuchsin 대조염색액
A. 용액 A
Basic fuchsin
Ethanol, 95%
0.3
10
g
mL
Basic fuchsin과 ethanol을 갈색병에 넣고 용해시킨다.
B. 용액 B
Phenol 결정 녹인 것
증류수
5
95
mL
mL
플라스크에 증류수를 넣고 phenol 결정 녹인 용액을 첨가한다. 용액 A에 용액 B를 넣은 후
실온에 보관하면 1년간 사용할 수 있다.
② 0.8% basic fuchsin 대조염색액
Basic fuchsin
증류수
0.8
100
g
mL
Basic fuchsin을 갈색병에 넣고 basic fuchsin이 완전히 용해되도록 증류수를 조금씩 첨가하면서
잘 섞는다. 실온에 보관하면 1년간 사용할 수 있다.
(3) 혐기성 세균을 위한 Kopeloff 변법
① Alkaline crystal violet
A. 용액 A
Crystal violet (90-95%)
증류수
10
1,000
g
mL
유리그릇에서 잘 섞은 다음 실온에서 보관하면 1년 동안 사용할 수 있다.
B. 용액 B: Sodium bicarbonate (NaHCO3)
Sodium bicarbonate(NaHCO3)
증류수
50
1,000
g
mL
② Kopeloff iodine
Sodium hydroxide (NaOH)
증류수
Iodine crystal
Potassium iodide
증류수
4
25
20
1
975
g
mL
g
g
mL
NaOH를 25 mL의 증류수로 녹여 갈색병에 넣고 iodine crystal과 potassium iodide를 첨가한
다음 잘 섞은 후 975 mL 증류수를 조금씩 첨가하면서 잘 섞는다.
③ 탈색제
Ethanol, 95%
Acetone
700
300
mL
mL
갈색병에서 잘 섞은 후 실온에 보관하면 1년간 사용할 수 있다.
④ 대조염색 (Kopeloff safranin)
Safranin O
Ethanol, 95%
증류수
20
100
1,000
g
mL
mL
1,000 mL 유리병에 safranin O를 충분히 녹일 수 있는 양 (보통 50 mL가 필요함)만 첨가한 후
증류수 1,000 mL를 넣은 다음 실온에 보관하면 1년간 사용할 수 있다.
도말작업부터는
3) 정도관리
(1) 육안으로 매일 관찰할 사항
① Crystal violet 침전물이 있을 때에는 여과하여 침전물을 제거한 후 사용해야 한다.
② 시약 용액이 증발되면 좋은 염색 결과를 얻을 수 없으므로 사용액은 일정기간마다 교체하여 사용
해야 한다.
(2) 시약이 바뀔 때나 하루에 한번 Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus epidermidis (ATCC
12228) 또는 S. aureus (ATCC 25923) 균주로 그람염색하여 정도관리를 시행하여 E. coli는 분홍색,
S. aureus은 짙은 보라색을 확인한다.
(3) 그람염색의 판독이 어렵거나 염색 결과가 부정확할 때는 원인을 찾아내어 해결해야한다. 그람양성세균이
흐리게 염색되거나 그람음성간균에 crystal violet가 묻어 있을 때 또는 도말 표본의 가장자리에만
염색이 됐을 때는 검체의 도말 제작, 염색 시약 및 염색 과정에 문제가 있을 때 발생한다.
다음은 질이 나쁜 염색결과의 흔한 원인들이다.
① 재생 슬라이드를 깨끗이 닦지 않고 사용하거나 새 슬라이드에 묻어 있는 기름기를 제거하지 않고
염색을 시행했을 때
② 검체를 너무 두껍게 도말했을 때
③ 슬라이드를 과열하여 고정했을 때
④ 염색 과정 중에 세척을 오래하거나 강하게 했을 때
(4) 그람염색의 결과 보고를 다시 확인하는 체계를 구축하여 그람염색 판독의 정확성을 유지한다.
① 책임자 또는 부서장은 매일 그람염색 표본을 추출한 후 결과를 확인하는 작업을 시행하여 검사자
교육의 필요성을 결정하거나 임상적 연관성에 대한 조언을 주는데 도움을 줄 수 있다.
② 최종 배양 결과와 그람염색 결과를 비교한다. 그람염색에서 관찰된 균 형태는 배양에서도 분리
되어야 하며 그람염색에서 보고되지 않은 균종이 분리되면 염색과 배양 결과를 다시 확인해야
한다. 그러나 그람염색에서 관찰되지 않아도 배양에서는 분리될 수 있다.
③ 참고가 되는 표준 슬라이드는 직원의 교육과 결과 비교에 매우 중요하다.
4) 도말
(1) 도말 표본 제작의 기본적인 원칙
좋은 도말 표본은 균종이 조밀하여 쉽게 관찰할 수 있으며 균종의 배열형태를 확인할 수 있을 정도의 단일막 두께로 제작해야 한다. 깨끗한 새 슬라이드 [(25 X 75 mm (1 X 3 inch)]를 알코올이 담져진 용기에 보관한 후 사용 전에 꺼내어 공기 중에 말리거나 가열한 다음 사용하면 가장 좋은 결과를 얻을 수 있다. 슬라이드 한쪽 끝이 반투명 유리로 제작된 것은 작업번호의 기입과 조작에 편리하다. 도말 표본 제작을 위하여 검체를 다룰 때에는 라텍스 장갑과 일반적인 주의사항에 맞는 보호장비를 착용해야 한다.
(2) 임상 검체별 도말 표본 제작
① 면봉
A. 세포 성분과 균배열 형태가 파괴되지 않도록 면봉을 부드럽게 슬라이드 위에 돌려가면서 도말
한다.
B. 1개의 면봉으로 도말과 배양을 동시에 검사할 경우에는 면봉을 식염수가 들어 있는 멸균 관에
넣고 진탕기로 잘 푼 다음 면봉을 관의 벽에 대고 짜낸 검체로 도말 표본을 제작하고 남은 검체
는 접종에 사용한다.
② 흡인액, 삼출물, 객담, 대변 등과 같은 면봉이외의 검체
A. 시린지로 채취한 검체는 먼저 멸균 관에 옮긴다. 필요에 따라 진탕기를 사용할 수도 있다.
B. 대가지, 피펫, 백금이 등으로 농성이 심하거나 혈액이 묻어 있는 부위를 취하여 슬라이드 위에
놓은 후 새 슬라이드를 덮은 다음 위아래의 슬라이드를 서로 반대방향으로 당겨 얇은 도말
표본을 만든다. 슬라이드 옆으로 검체가 흐르면 소독제를 적신 일회용 종이 타월로 닦는다.
너무 두껍거나 농성이 심하여 얇은 도말 표본제작이 어려울 때는 식염수 몇 방울을 슬라이드에
떨어뜨린 후 도말하면 된다. 이러한 모든 검사과정은 안전상자 안에서 작업해야 한다.
③ 뇌척수액과 체액
A. 세포원심기를 이용한 방법
세포원심기 (cytospin slide centrifuge)는 그람염색의 예민도를 증가시키며 원심분리와 검사에
소요되는 시간이 감소되므로 보다 신속한 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다.
B. 원심분리법
피펫으로 침전물이 0.5 mL 정도 남게 상청액을 제거한 후 상청액은 멸균 관에 담고 침전물은
진탕하거나 Pasteur 피펫으로 빨기와 뿜기를 몇 번하여 섞은 다음 Pasteur 피펫으로 침전물
한 방울을 슬라이드 위에 떨어뜨린 후 공기 중에서 말린다. 주의할 점은 침전물을 펼쳐서 도말
하면 안되며 세균 관찰을 쉽게 하기 위해 검체 농도를 농축하려면 처음 위치에 침전물 한 방울
을 다시 떨어뜨려 겹치게 한다.
④ 요
요 검체는 원심분리하지 않고 잘 섞은 후 Pasteur 피펫으로 한 방울을 슬라이드에 떨어뜨린 다음
공기 중에서 말리며 펼쳐서 도말하면 안된다.
⑤ 마른 검체 또는 양이 적은 검체
멸균 식염수 0.5 mL로 검체를 유화 시킨 후 Pasteur 피펫으로 한 방울을 슬라이드에 떨어뜨린 다음
피펫 끝으로 검체를 펼쳐 면이 고른 얇은 도말을 만든다.
⑥ 생검과 조직
터치 도말로 표본을 만들거나 조직을 균질화 시킨 후 표본을 만들 수 있다. 도말 제작 전에 조직을
균질화하면 종종 세포의 특징적인 모양과 배열형태를 관찰할 수 없다. 터치 도말 표본은 검체를
페트리 접시 위에 놓고 수술용 칼로 조직을 잘게 썲은 후 조각난 검체를 집게로 잡아 슬라이드 위에
문지른다. 조직의 균질화 후에 얻은 검체는 피펫으로 한 방울을 취하여 슬라이드에 떨어뜨린 다음
슬라이드의 1/4정도 넓이로 펼친다.
(3) 액체배지로 도말 표본을 제작하는 방법
액체배양배지의 도말은 한 개의 슬라이드에 여러 배지를 도말하면 염색과정 중에 한쪽이 다른 쪽으로 씻겨 내려갈 수 있으므로 한 개의 슬라이드에 한 개의 도말 표본을 만드는 것이 좋다. 도말 방법은 Past-
eur 피펫으로 배지 한두 방울을 슬라이드에 떨어뜨린 후 얇게 펼친다. 혈액 배양용 배지에 부착된 통기바늘을 이용하면 조작 과정 중에 발생할 수 있는 오염 가능성을 줄일 수 있다.
(4) 고체배지의 집락으로 도말 표본을 제작하는 방법
증류수는 세포벽이 약한 균종의 형태를 변형시킬 수 있으므로 멸균 식염수나 물 한 방울을 슬라이드 위에 떨어뜨린 후 댓가지나 백금이로 집락의 일부분을 취하여 식염수와 부드럽게 섞어 에어로졸이 생기지 않도록 한다. 도말액은 약간 흐리고 균질하도록 식염수 양, 도말 범위, 접종 균량 등을 맞춘다. 접종량이 너무 많거나 식염수 양이 적을 때 또는 도말 범위를 너무 좁게 펼치면 도말을 말린 후 마른 자국이 여러 개 보인다.
5) 도말 고정
(1) 가열법
가열법은 도말 표본을 공기 중에서 말린 후 불꽃에 두세 번 통과시키거나 슬라이드를 소형소각기 (microincinerator) 앞에 5-10초간 갖다 댄다. 또는 도말 표본을 60℃ 전기발열판에 놓고 말린다. 두 방법 모두 세포 성분이 변형되지 않으려면 과열을 피해야 하며 슬라이드를 식힌 후 염색한다.
(2) 메탄올 고정법
이 방법은 적혈구의 용혈이 없으므로 슬라이드의 배경이 깨끗하며 요 검체가 씻겨져 나가는 것을 방지하는 장점이 있다. 고정방법은 슬라이드를 공기 중에서 말린 후 메탄올 몇 방울을 슬라이드에 떨어뜨려 1분 동안 고정한 다음 슬라이드를 세워 남아있는 메타놀이 흘러내리면 다시 공기 중에 말린다. 이 때 물로 세척하거나 가열하면 안된다.
6) 염색 과정
(1) Hucker 변법
① 고정한 도말 표본 위에 crystal violet를 넘칠 정도로 부은 후 30초간 염색한 다음 crystal violet를
흘려 버린다.
② 슬라이드 뒷면 모서리에 수돗물을 조금씩 흘려서 씻는다. 수돗물을 너무 세게 틀면 도말한 검체가
떨어져 나갈 수 있으며 세척 시간이 길면 그람양성세균에 붙어있던 crystal violet가 씻겨 나갈 수
있으므로 조심해야 한다. 흐르는 물통에서 슬라이드를 세척할 때는 보통 5초간 담근 후 꺼낸다.
③ Iodine 용액으로 슬라이드에 묻은 물을 세척한 후 신선한 iodine 사용액을 슬라이드 위에 넘칠 정도
로 부은 후 30초 동안 염색한 다음 수돗물을 조금씩 흘려서 씻는다.
④ 슬라이드를 비스듬한 채로 탈색제를 부어 자색 물이 더 이상 안 나오면 중단한다. 탈색 시간은
도말의 두께와 탈색제 종류에 따라 조정해야 한다.
⑤ 약하게 흐르는 물로 씻고 safranin을 슬라이드 위에 넘칠 정도로 부은 후 30초 동안 대조염색한
다음 흐르는 물로 씻는다.
⑥ 슬라이드를 세워서 공기 중에 말리거나 슬라이드 자동 건조기를 이용한다.
⑦ 저배율로 도말 표본을 검경하여 균과 세포 분포 및 염색 시약이 뭉쳐있는지를 확인한 후 뭉쳐있는
염색 시약이 많을 때에는 도말 표본을 새로 만든 후 crystal violet를 재여과한 시약으로 다시 염색
한다.
* Carbol-fuchsin 대조염색법은 Hucker 변법과 유사하나 탈색제로 95% ethanol을 사용한 후
carbol-fuchsin 또는 0.8% basic fuchsin으로 염색하는 것이 다르다 (표 5-1).
(2) Kopeloff 변법
① 고정한 도말 표본 위에 alkaline crystal violet 용액을 넘칠 정도로 부은 후 NaHCO3 사용액
다섯 방울을 첨가한 다음 2-3분간 나둔다.
② Kopeloff iodine으로 씻은 후 다시 Kopeloff iodine을 얹고 2분 이상 염색한다.
③ 슬라이드를 비스듬히 들은 채로 탈색제를 부은 후 즉시 세척한다.
④ Kopeloff safranin으로 30초 이상 대조염색한 후 수돗물을 조금씩 흘려서 씻은 다음 말린다
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