: Biuret 반응에 의한 단백질 정량
2. 실험 조
: 1 조
3. 성명
: 송 영 주
4. 실험 목적
: Biuret 반응을 통해 단백질을 정량한다.
5. 시약 및 실험 기구
: Biuret 시약(①구연산 나트륨-socium citrate 173g, 탄산 나트륨-sodium carbonate 100g을 300ml의 증류수에 용해시킨다. ②황산 동-Cupric Sulfate CuSO4 5H2O 17.3g을 100ml의 증류수에 용해한다. ①과②를 더해서 total 1l로 정용한다.)
6%(w/v) NaOH 용액(6g/100ml), 단백질 표준용액 BSA(bovine serum albumin) 2mg/ml, 시험관, 피펫, 증류수, 세척병, 시험관대, 흡광도계(OD)
6. 실험 방법
① 시험관 7개를 준비한다.
② 준비된 Biuret 시약, 6%(w/v) NaOH 용액, 단백질 표준용액 BSA, 증류수를 아래의 표의 양만큼 각각의 시험관에 넣은 후 15분간 실온에서 정치한다.
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시험관 시약 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
BSA |
0 |
0.1 |
0.2 |
0.4 |
0.8 |
1.6 |
미지시료0.25 |
|
H2O |
2 |
1.9 |
1.8 |
1.6 |
1.2 |
0.4 |
1.75 |
|
6%NaOH |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
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Biuret 시약 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
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Total |
6 |
6 |
6 |
6 |
6 |
6 |
6 |
③ 540nm에서 OD를 측정한다.
④ 1∼6번 시험관의 OD측정값을 이용 검량선을 작성한다.
⑤ 미지시료(7번째 시험관)의 측정된 OD값을 이용 단백질 함량을 계산한다.
7. 실험 결과 및 고찰
고찰> Cu2+는 ammonia complex 이온(Cu(NH3)2+-담청색)을 형성하며 peptide 분자와 결합해서 염기조건 F에서 착체를 형성한다. (Violet 정색) 검출 강도는 0.25∼200mg of protein (cf. Lowry 반응-1∼200㎍ 단백질)
Biuret 정색반응의 원리에서와 같이 강알칼리성 수용액 중에서 polypeptide는 2가의 구리이온(Cu2+)과 착염을 형성하여 자색을 나타내므로 이 반응의 강도를 비색 정량하는 방법이다.
8. 참고 문헌.
문 헌 : 표준 식품분석법
출판사 : 지구 문화사
저 자 : 채수규, 강갑석, 마상조, 방광웅, 오문헌