Ⅰ. 정의
Polymerase chain reaction : 중합효소연쇄반응
1983년에 미국 Cetus사의 Kary Mullis에 의해 고안되어 1988년 Saiki사가 Thermus aquaticus(Taq) polymerase를 분리하여 중합효소연쇄 반응에 이용하게 되었다. 생물체의 핵이나 소기관에 존재하는 미량의 DNA를 어느 임의 또는 특정의 염기서열을 가진 2개의 oligonucleotide primer를 사용하여 대량으로 증폭되어 진다.
Ⅱ. PCR 반응구성 요소
1. Primer set
Primer set은 forward/reverse primer라고도 부르는데 이는 DNA의 방향성과 관련이 있는 용어이다. 자세한 내용은 다음에 언급하기로 하고 일단 primer set은 원하는 target region의 상보적 strand의 각 5’부위의 끝에 있는 수십 base pairs 정도의 sequences대로 인위적으로 합성한 oligonucleotides라고 이해하면 된다. 중요한 point는 상보적이라는 것과 3' end 에서 부터 Taq polymerase가 작용해 새로운 strand를 합성해 나가기 시작한다는 것이다.
2. dNTPs
dNTPs는 nucleic aicds (DNA,RNA)를 구성하는 LEGO block 같은 것으로 이해하면 된다. 중요한 것은 hydrogen bond가 3개인 GC 결합이 2개인 AT 결합보다 안정적이라는 것과 dNTPs는 단순한 building block의 역할을 하는 것 뿐만이 아니라 polymerase가 nucleic acids를 합성해 나가는데 필요한 energy를 제공하는 역할도 한다는 것이다.
3. Taq polymerase
Taq polymerase는 일반적으로 thermostable 혹은 heat-stable polymerase를 의미하나 원래는 그 기원이 Thermus aquaticus 라는 미생물에서 유래한 polymerase를 지칭하는 용어이다. 이 enzyme은 5’-> 3’ polymerization-dependent exonuclease activity를 가지고 있고 60bps/sec이 속도로 DNA를 합성해 나간다.
Ⅲ. PCR의 일반적인 과정
1. Pre-PCR status
PCR이 시작되기 전 실온의 buffer condition에서 추출한 DNA는 안정적인 B form double helix구조를 이루고 있다. 이 추출한 DNA를 원본으로 primer의 biding과 extension이 일어나기 때문에 이를 특히 templates라고 부르기도 한다.
2. Denaturation
DNA의 sugar-phosphate backbone chain은 phosphodiester bond라는 공유 결합으로 이루어져 있어 base간의 결합인 hydrogen bond보다 약 10배 정도 강한 힘으로 결합이 되어 있다. 그러므로 적절한 energy(열)에 의해서 double strand가 single strand로 denature될 때 각 single strand의 backbone chain은 손상 없이 두 가닥의 strand로 풀어진다. PCR에서 base pairs간의 hydrogen bond를 끊기 위해 사용하는 energy는 열인데 보통 90oC까지 열을 가하면 single strnad로 풀어진다. 이 denaturation은 fraying (DNA의 양 말단은 항상 물에 노출이 되어 있고 물 분자는 각 base와 수소결합을 할 수 있기 때문에 온도가 올라가면 double strand의 끝이 풀어지게 되는 것)과 breathing(base pairs가 물 분자와의 수소결합에 의해 끊어진 bubble이 double helix의 내부를 움직이고 있는 것) 때문에 일어나게 된다. Denaturation온도가 너무 낮으면 snap-back 현상이 일어날 수도 있다.
3. Annealing
Single strand로 풀어진 templates에 primer가 각각의 상보적인 sequence를 찾아서 biding하는 과정으로 binding, annealing, hybridization등 다양한 용어로 부른다. PCR의 최종적인 sensitivity와 specificity를 결정하는 제일 중요한 과정이다. Primer는 templates 같은 긴 DNA와는 달리 보통 15 bps이상 30bps이하의 oligonucleotide를 사용하는데 이런 짧은 DNA의 hybridization temperature를 결정하는 데에는 length, GC content, pH, salt concentration등 여러 요소가 영향을 미친다. 이 과정에서 primer가 biding하여 free 3’ end를 제공하면 여기서 polymerase가 chain extension을 시작한다. 실제로는 PCR에 사용하는 Taq polymerase의 활성 온도 이상의 annealing temperature를 가지는 primer는 사용할 수 없다.
4. Extension
Taq polymerase가 primer의 3’end의 free OH기를 시작점으로 해서 single strand template의 상보적인 dNTP를 가져와서 붙여 나가며 chain extension을 시행한다. 처음 cycle에서는 template를 기준으로 합성이 되므로 target sequence와는 상관없이 3’방향으로 60 bps/sec의 속도로 계속 합성이 되어 나간다. 이론적으로는 template의 5' end까지 합성이 되어 나갈 수 있지만 extension time이 무한대가 아니므로 다음 cycle의 denaturation step까지 합성이 된다. 보통 500bps 이하의 size는 20초면 충분한 extension이 되는 것으로 알려져 있다.
Ⅳ. PCR 기법의 응용
1. Single-stranded Conformational Polymorphism-PCR(SSCP-PCR)
어떤 입자들의 전기장 내에서의 이동속도는 그 입자의 크기와 형태에 영향을 받는다. Single strand DNA는 non-denaturing 조건하에서 분자내의 상호작용에 의하여 2차 구조를 형성하게 되는데 이 2차 구조는 DNA의 염기서열에 의하여 결정돤다. 그러므로 DNA 염기서열중 하나의 염기서열의 변화(point mutation, deletion 또는 insertion)에 의해서도 전기영동상 전개되는 속도에 영향을 받으므로 이동거리에 차이가 발생하게 된다. 이와 같은 원리를 바탕으로 1989년 Orita 등에 의하여 고안된 SSCP는 유전자의 돌연변이를 검색하는 유용한 도구로서 사용되고 있다.
2. Direct Sequencing of PCR Products
단일나선이나 이중나선의 PCR 증폭 DNA를 직접 sequencing 반응의 template로 사용하는 기법이다. 이들 단일나선 또는 이중나선 DNA는 비교적 짧은 선형의 분자이기 때문에, 쉽게 재결합하거나 DNA 말단염기에 의한 이차구조가 형성되어 sequencing primer는 본래 PCR primer가 아닌 제3의 'nested primer'를 사용하고, 이차구조의 형성을 막기 위해서는 고온에서의 sequencing 반응이 진행되도록 하는 것이 효과적이다. 이 기법의 잇점은 ① 경제적, 시간적인 수고의 경감 ②DNA의 알칼리 변성과 EtOH 침전 과정의 생략 ③ 평균 450의 염기서열을 결정 ④ 고온의 PCR 과정을 통한 primer 특이성의 효율 증가와 template의 이차구조 형성 감소 ⑤ Taq DNA polymerase의 error의 무시 ⑥ 두 대립유전자의 동시 검색 ⑦ 적은 양의 증폭 DNA의 template 만을 사용할 수 있다.
3. Reverse Transcriptation-PCR(RT-PCR)
mRNA의 탐색은 특정유전자의 발현 및 기능을 효과적으로 분석할 수 있는 방법으로 이용되고 있으며, PCR이 도입됨으로써 mRNA 수준을 보다 빠르고 정확하게 분석할 수 있게 되었다. RT-PCR은 크게 reverse transcriptase에 의한 역전사와 Taq DNA polymerase에 의한 PCR의 연속적인 두 과정에 따라 진행된다.
4. Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE)
RACE는 특정 mRNA로부터 그 RNA의 3'말단과 내부염기 사이(3'RACE), 혹은 5'말단과 내부염기 사이(5'RACE)의 절편만을 선택적으로 증폭할 수 있는 기법으로 'one-sidesd'이라고도 한다. 그러므로 RT-PCR로는 기대할 수 없는 mRNA의 말단중, 특히 5'말단을 확보할 수 있기 때문에, 특정 mRNA의 전체염기서열에 대한 cDNA를 빠르고 효과적으로 증폭할 수 있다. RACE의 기본원리 및 절자는 RT-PCR과 동일하지만 RACE에서는 oligo(dt) primer를 사용한다는 점에서 다르다.
5. RAPD-PCR법
RAPD-PCR법은 내열성 DNA 중합효소인 Taq polymerase를 처리하여 유전자나 DNA의 특정부위에서 증폭된 다형성 DNA 단편들을 이용하여 분석하는 방법으로 친 계통간에도 유연관계를 분류하는데 훨씬 객관적일 뿐만 아니라 시간과 노력이 적게 들어 간편하게 분석할 수 있는 잇점이 있다. RAPD-PCR법에 의한 분류 및 검정의 또 다른 이점은 종에 특이적으로 나타나는 유전자 표식자(marker)를 찾을 수 있다는 것이다. 이미 수량성이나 품질 및 경제적인 면에서 재배가치가 인정된 품종에 대한 명확한 유전자 표식자를 찾을 수 있다면, 그 종에 대한 간편한 분류지표(fingerprint)로 사용됨은 물론, 우량종자의 지적소유권의 확보에도 명확하고 객관적인 방법이 제공 될 것이다.
Ⅴ. PCR 기술의 응용
▣ PCR을 통해 성취할 수 있는 모든 것은 이미 결정된 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다는 것인데, 이를 위해서는 반드시 증폭하고자 하는 부위의 경계 부분의 염기서열을 알아야 한다는 단점이 있다.
1. PCR을 이용한 적은 양의 DNA 연구
한 가닥의 머리카락이나 혈흔을 이용한 유전학적 지문법을 통하여 범인들이 법망을 피할 수 없도록 함으로써 법의학 분야에서 그 중요성이 증대되고 있다. 또한 매우 부패하여 일반적인 방법으로는 신분 확인이 어려운 피살자의 뼈로부터 DNA를 증폭시키는 데도 사용된다.
2. PCR의 임상 진단에의 응용
RFLP는 개인에 대한 라이브러리를 제작하고 돌연변이 유전자를 포함한 클론을 분리하고 그 염기서열을 분석해야 한다는 의미이다(a). 그러나 PCR은 유전체의 일부를 증폭하고, 그 산물을 직접 분석하여 염기서열에 관한 정보를 신속하게 얻을 수 있는 매우 실용적인 대안이다.(b)
또한, 병원성 질병의 진단에도 이용된다. 예를 들어 인간 샘플에 포함되어 있는 바이러스 DNA의 증폭을 통하여 그 증상이 나타나기 몇 일, 몇 주, 또는 몇 달 전에 진단이 가능하며, 많은 질병들, 특히 바이러스에 의해 유도되는 암들(파필로마바이러스에 의해 발생되는 자궁암)의 조기 진단을 통해 성공적인 치료 가능성을 향상 시켰다.
3. PCR의 RNA 증폭에의 이용
RNA 분자도 역전사효소에 의해 단일 사슬 cDNA로 전환된다면 증폭 가능하다. 이러한 예비 과정을 완료하고 PCR 프라이머와 Taq 중합효소를 첨가한 후 그 후과정은 일반적인 PCR 방법과 동일하게 수행한다. 이 RT-PCR은 mRNA의 양을 측정하는 데 유용하게 이용될 수 있다. 한 세포에서 어떤 mRNA의 양을 측정함으로써 그 유전자 발현의ㅏ 변화를 검사할 수 있다.
4. 상이한 유전체들의 비교를 위한 PCR
프라이머로 증폭시킨 PCR 산물을 전기영동 하였을 때 나타나는 밴드의 형태가 주형으로 사용된 DNA 분자의 전체적 구조를 반영한다. 즉, 어떤 세포의 전체 DNA를 증폭시켰을 때 나타나는 밴드의 형태는 그 세포의 유전체 구성을 나타내는 것이다. 따라서 같은 종이나 혹은 다른 종이던 간에 두 개체들 간의 유전체의 차이점은 임의(random) 프라이머를 이용한 PCR로 측정될 수 있다. 서로 유연 관계가 가까운 개체간일수록 비슷한 밴드의 양상을 나타내게 된다. 이러한 방법을 random amplified polymorphic DNA(RAPD) 분석이라 한다.
**1학기때 제가 발표했던 것입니다. 많이 부족하지만...
도움이 되었으면 하는 바램에서... 그림이 안 나와 좀 아쉽네요~**
Polymerase chain reaction : 중합효소연쇄반응
1983년에 미국 Cetus사의 Kary Mullis에 의해 고안되어 1988년 Saiki사가 Thermus aquaticus(Taq) polymerase를 분리하여 중합효소연쇄 반응에 이용하게 되었다. 생물체의 핵이나 소기관에 존재하는 미량의 DNA를 어느 임의 또는 특정의 염기서열을 가진 2개의 oligonucleotide primer를 사용하여 대량으로 증폭되어 진다.
Ⅱ. PCR 반응구성 요소
1. Primer set
Primer set은 forward/reverse primer라고도 부르는데 이는 DNA의 방향성과 관련이 있는 용어이다. 자세한 내용은 다음에 언급하기로 하고 일단 primer set은 원하는 target region의 상보적 strand의 각 5’부위의 끝에 있는 수십 base pairs 정도의 sequences대로 인위적으로 합성한 oligonucleotides라고 이해하면 된다. 중요한 point는 상보적이라는 것과 3' end 에서 부터 Taq polymerase가 작용해 새로운 strand를 합성해 나가기 시작한다는 것이다.
2. dNTPs
dNTPs는 nucleic aicds (DNA,RNA)를 구성하는 LEGO block 같은 것으로 이해하면 된다. 중요한 것은 hydrogen bond가 3개인 GC 결합이 2개인 AT 결합보다 안정적이라는 것과 dNTPs는 단순한 building block의 역할을 하는 것 뿐만이 아니라 polymerase가 nucleic acids를 합성해 나가는데 필요한 energy를 제공하는 역할도 한다는 것이다.
3. Taq polymerase
Taq polymerase는 일반적으로 thermostable 혹은 heat-stable polymerase를 의미하나 원래는 그 기원이 Thermus aquaticus 라는 미생물에서 유래한 polymerase를 지칭하는 용어이다. 이 enzyme은 5’-> 3’ polymerization-dependent exonuclease activity를 가지고 있고 60bps/sec이 속도로 DNA를 합성해 나간다.
Ⅲ. PCR의 일반적인 과정
1. Pre-PCR status
PCR이 시작되기 전 실온의 buffer condition에서 추출한 DNA는 안정적인 B form double helix구조를 이루고 있다. 이 추출한 DNA를 원본으로 primer의 biding과 extension이 일어나기 때문에 이를 특히 templates라고 부르기도 한다.
2. Denaturation
DNA의 sugar-phosphate backbone chain은 phosphodiester bond라는 공유 결합으로 이루어져 있어 base간의 결합인 hydrogen bond보다 약 10배 정도 강한 힘으로 결합이 되어 있다. 그러므로 적절한 energy(열)에 의해서 double strand가 single strand로 denature될 때 각 single strand의 backbone chain은 손상 없이 두 가닥의 strand로 풀어진다. PCR에서 base pairs간의 hydrogen bond를 끊기 위해 사용하는 energy는 열인데 보통 90oC까지 열을 가하면 single strnad로 풀어진다. 이 denaturation은 fraying (DNA의 양 말단은 항상 물에 노출이 되어 있고 물 분자는 각 base와 수소결합을 할 수 있기 때문에 온도가 올라가면 double strand의 끝이 풀어지게 되는 것)과 breathing(base pairs가 물 분자와의 수소결합에 의해 끊어진 bubble이 double helix의 내부를 움직이고 있는 것) 때문에 일어나게 된다. Denaturation온도가 너무 낮으면 snap-back 현상이 일어날 수도 있다.
3. Annealing
Single strand로 풀어진 templates에 primer가 각각의 상보적인 sequence를 찾아서 biding하는 과정으로 binding, annealing, hybridization등 다양한 용어로 부른다. PCR의 최종적인 sensitivity와 specificity를 결정하는 제일 중요한 과정이다. Primer는 templates 같은 긴 DNA와는 달리 보통 15 bps이상 30bps이하의 oligonucleotide를 사용하는데 이런 짧은 DNA의 hybridization temperature를 결정하는 데에는 length, GC content, pH, salt concentration등 여러 요소가 영향을 미친다. 이 과정에서 primer가 biding하여 free 3’ end를 제공하면 여기서 polymerase가 chain extension을 시작한다. 실제로는 PCR에 사용하는 Taq polymerase의 활성 온도 이상의 annealing temperature를 가지는 primer는 사용할 수 없다.
4. Extension
Taq polymerase가 primer의 3’end의 free OH기를 시작점으로 해서 single strand template의 상보적인 dNTP를 가져와서 붙여 나가며 chain extension을 시행한다. 처음 cycle에서는 template를 기준으로 합성이 되므로 target sequence와는 상관없이 3’방향으로 60 bps/sec의 속도로 계속 합성이 되어 나간다. 이론적으로는 template의 5' end까지 합성이 되어 나갈 수 있지만 extension time이 무한대가 아니므로 다음 cycle의 denaturation step까지 합성이 된다. 보통 500bps 이하의 size는 20초면 충분한 extension이 되는 것으로 알려져 있다.
Ⅳ. PCR 기법의 응용
1. Single-stranded Conformational Polymorphism-PCR(SSCP-PCR)
어떤 입자들의 전기장 내에서의 이동속도는 그 입자의 크기와 형태에 영향을 받는다. Single strand DNA는 non-denaturing 조건하에서 분자내의 상호작용에 의하여 2차 구조를 형성하게 되는데 이 2차 구조는 DNA의 염기서열에 의하여 결정돤다. 그러므로 DNA 염기서열중 하나의 염기서열의 변화(point mutation, deletion 또는 insertion)에 의해서도 전기영동상 전개되는 속도에 영향을 받으므로 이동거리에 차이가 발생하게 된다. 이와 같은 원리를 바탕으로 1989년 Orita 등에 의하여 고안된 SSCP는 유전자의 돌연변이를 검색하는 유용한 도구로서 사용되고 있다.
2. Direct Sequencing of PCR Products
단일나선이나 이중나선의 PCR 증폭 DNA를 직접 sequencing 반응의 template로 사용하는 기법이다. 이들 단일나선 또는 이중나선 DNA는 비교적 짧은 선형의 분자이기 때문에, 쉽게 재결합하거나 DNA 말단염기에 의한 이차구조가 형성되어 sequencing primer는 본래 PCR primer가 아닌 제3의 'nested primer'를 사용하고, 이차구조의 형성을 막기 위해서는 고온에서의 sequencing 반응이 진행되도록 하는 것이 효과적이다. 이 기법의 잇점은 ① 경제적, 시간적인 수고의 경감 ②DNA의 알칼리 변성과 EtOH 침전 과정의 생략 ③ 평균 450의 염기서열을 결정 ④ 고온의 PCR 과정을 통한 primer 특이성의 효율 증가와 template의 이차구조 형성 감소 ⑤ Taq DNA polymerase의 error의 무시 ⑥ 두 대립유전자의 동시 검색 ⑦ 적은 양의 증폭 DNA의 template 만을 사용할 수 있다.
3. Reverse Transcriptation-PCR(RT-PCR)
mRNA의 탐색은 특정유전자의 발현 및 기능을 효과적으로 분석할 수 있는 방법으로 이용되고 있으며, PCR이 도입됨으로써 mRNA 수준을 보다 빠르고 정확하게 분석할 수 있게 되었다. RT-PCR은 크게 reverse transcriptase에 의한 역전사와 Taq DNA polymerase에 의한 PCR의 연속적인 두 과정에 따라 진행된다.
4. Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE)
RACE는 특정 mRNA로부터 그 RNA의 3'말단과 내부염기 사이(3'RACE), 혹은 5'말단과 내부염기 사이(5'RACE)의 절편만을 선택적으로 증폭할 수 있는 기법으로 'one-sidesd'이라고도 한다. 그러므로 RT-PCR로는 기대할 수 없는 mRNA의 말단중, 특히 5'말단을 확보할 수 있기 때문에, 특정 mRNA의 전체염기서열에 대한 cDNA를 빠르고 효과적으로 증폭할 수 있다. RACE의 기본원리 및 절자는 RT-PCR과 동일하지만 RACE에서는 oligo(dt) primer를 사용한다는 점에서 다르다.
5. RAPD-PCR법
RAPD-PCR법은 내열성 DNA 중합효소인 Taq polymerase를 처리하여 유전자나 DNA의 특정부위에서 증폭된 다형성 DNA 단편들을 이용하여 분석하는 방법으로 친 계통간에도 유연관계를 분류하는데 훨씬 객관적일 뿐만 아니라 시간과 노력이 적게 들어 간편하게 분석할 수 있는 잇점이 있다. RAPD-PCR법에 의한 분류 및 검정의 또 다른 이점은 종에 특이적으로 나타나는 유전자 표식자(marker)를 찾을 수 있다는 것이다. 이미 수량성이나 품질 및 경제적인 면에서 재배가치가 인정된 품종에 대한 명확한 유전자 표식자를 찾을 수 있다면, 그 종에 대한 간편한 분류지표(fingerprint)로 사용됨은 물론, 우량종자의 지적소유권의 확보에도 명확하고 객관적인 방법이 제공 될 것이다.
Ⅴ. PCR 기술의 응용
▣ PCR을 통해 성취할 수 있는 모든 것은 이미 결정된 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다는 것인데, 이를 위해서는 반드시 증폭하고자 하는 부위의 경계 부분의 염기서열을 알아야 한다는 단점이 있다.
1. PCR을 이용한 적은 양의 DNA 연구
한 가닥의 머리카락이나 혈흔을 이용한 유전학적 지문법을 통하여 범인들이 법망을 피할 수 없도록 함으로써 법의학 분야에서 그 중요성이 증대되고 있다. 또한 매우 부패하여 일반적인 방법으로는 신분 확인이 어려운 피살자의 뼈로부터 DNA를 증폭시키는 데도 사용된다.
2. PCR의 임상 진단에의 응용
RFLP는 개인에 대한 라이브러리를 제작하고 돌연변이 유전자를 포함한 클론을 분리하고 그 염기서열을 분석해야 한다는 의미이다(a). 그러나 PCR은 유전체의 일부를 증폭하고, 그 산물을 직접 분석하여 염기서열에 관한 정보를 신속하게 얻을 수 있는 매우 실용적인 대안이다.(b)
또한, 병원성 질병의 진단에도 이용된다. 예를 들어 인간 샘플에 포함되어 있는 바이러스 DNA의 증폭을 통하여 그 증상이 나타나기 몇 일, 몇 주, 또는 몇 달 전에 진단이 가능하며, 많은 질병들, 특히 바이러스에 의해 유도되는 암들(파필로마바이러스에 의해 발생되는 자궁암)의 조기 진단을 통해 성공적인 치료 가능성을 향상 시켰다.
3. PCR의 RNA 증폭에의 이용
RNA 분자도 역전사효소에 의해 단일 사슬 cDNA로 전환된다면 증폭 가능하다. 이러한 예비 과정을 완료하고 PCR 프라이머와 Taq 중합효소를 첨가한 후 그 후과정은 일반적인 PCR 방법과 동일하게 수행한다. 이 RT-PCR은 mRNA의 양을 측정하는 데 유용하게 이용될 수 있다. 한 세포에서 어떤 mRNA의 양을 측정함으로써 그 유전자 발현의ㅏ 변화를 검사할 수 있다.
4. 상이한 유전체들의 비교를 위한 PCR
프라이머로 증폭시킨 PCR 산물을 전기영동 하였을 때 나타나는 밴드의 형태가 주형으로 사용된 DNA 분자의 전체적 구조를 반영한다. 즉, 어떤 세포의 전체 DNA를 증폭시켰을 때 나타나는 밴드의 형태는 그 세포의 유전체 구성을 나타내는 것이다. 따라서 같은 종이나 혹은 다른 종이던 간에 두 개체들 간의 유전체의 차이점은 임의(random) 프라이머를 이용한 PCR로 측정될 수 있다. 서로 유연 관계가 가까운 개체간일수록 비슷한 밴드의 양상을 나타내게 된다. 이러한 방법을 random amplified polymorphic DNA(RAPD) 분석이라 한다.
**1학기때 제가 발표했던 것입니다. 많이 부족하지만...
도움이 되었으면 하는 바램에서... 그림이 안 나와 좀 아쉽네요~**
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