1. 원리
써던 불롯팅이 DNA를 다루는 작업인 반면에 노던 블롯팅은 RNA를 다루는 기술이다. 노던
블롯팅은 우선 원하는 세포나 조직에서 RNA를 추출해서 RNA의 크기별로 한천 겔에서 전기영동을 통하여 분리하게 된다. 이것을 다루기 쉬운 nitrocellulose 흡착지나 nylon흡착지에 옮긴 후 원하는 보합결합시킨 후 자가방사기록함으로써 원하는 전령 RNA의 크기와 상대적인 양을 측정하는 것이다.
2. 용도
모든 단백이 만들어지기 위해서는 우선 그 단백의 유전자로부터 전령 RNA가 만들어져야 한다.
이것을 전사라고 하며, 노던 블롯팅은 전사된 전령 RNA의 크기와 양을 분석하는데 쓰이게 된다.
3. 방법
노던 블롯팅은 RNA를 분석하는 가장 일반화된 방법이라고 할 수 있다. 원리는 DNA를 분석하는 써던 블롯팅과 아주 유사하다. 조직이나 세포에서 RNA를 분리하는 방법은 여러가지가 있으나 가장 중요한 점은 그 실험실에서 가장 익숙한 방법을 사용하는 것이다. 많은 실험실에서는 cesium chloride 원심분리법을 주로 사용한다. RNA를 추출하는 것은 DNA를 추출하는 것 보다 상당히 까다롭다. RNA는 단일쇄 구조로 되어 있어서 RNA 분해효소(RNase)에 의해 쉽게 분해되며 또한 RNA 분해효소는 상당히 안정하고 조효소가 없어도 활성화 된다는 것이다. 따라서 RNA를 분해 되지 않도록 분리하는 것이 노던 블롯팅의 가장 중요한 과정이라고 할 수 있다. 그러므로 시약이나 초자기구를 RNA 분해효소에 오염되지 않게 준비하는 것이 성공하는 비결이라고 할 수 있다.
4. 실험절차
1) 조직 또는 배양세포에서의 RNA분리
a. 조직을 채취하여 PBS로 세척 후 guanidinium isothiocyanate용액을 조직 1g당 5배 비율로 섞은 후 신속하게 액체 질소에 동결 시킨다. 배양세포의 경우 75㎠ 플라스크당 1ml의 위 용액을 넣어 rubber policeman으로 긁어 낸다.
b. Polytron조직 균질기로 조직을 균질화 시킨다. 이 때에는 반드시 얼음 위에서 균질화 시킨다.
c. 5분간 1,500g에서 원심분리하여 조직의 덩어리등을 제거한다.
d. 상층액을 따서 18게이지 바늘로 10회 정도 흡입과 토출을 시행한다.
e. 20분간 5,000g에서 원심분리하여 상층액만 얻는다.
f. Polyallomer 튜브에 cesium chloride로 쿠션을 만들고 그 위에 상층액을 얹어 놓는다.
g. 원심분리를 하게 되면 RNA는 튜브 밑바닥에 압착결정을 형성하게 된다. 따라서 상층액을 주의해서 따라내고 Kimwipe를 말아서 튜브에 넣고 벽에 붙은 CsCl용액을 제거하고 나머지는 튜브를 Kimwipe위에 1시간 정도 거꾸로 세워 제거한다.
h. 200㎕의 TES완충액을 각가의 튜브 밑바닥에 넣고 가끔 흔들어 주면서 실온에서 약 30-60분간 방치하고 Eppendorf튜브에 옮긴다.
i. 400㎕의 phenol/chloroform 1:1용액을 각각의 튜브에 넣고 진탕 혼합하여 2분간 실온에서 원침한다.
j. 상층액을 따서 다른 튜브에 옮기고 40㎕ 3M sodium acetate와 1ml의 100% 에탄올을 첨가하고 -20℃에서 12시간 이상 방치한다.
k. 10분간 4℃에서 원침하여 RNA압착결정을 얻는다.
l. 70% 에탄올로 세척하고 진공 건조 시킨다.
m. 건조된 RNA압착결정에 DEPC처리된 탈이온수를 넣어 녹인다.
n. 녹인 RNA는 분광광도계로 광학밀도를 재서 농도를 측정한다.
2) 전기영동을 위한 RNA검체 처리
a. 10-20㎍의 RNA를 취하여 진공건조 시킨다.
b. 한 검체당 2.5㎕ DEPC 처리된 증류수 4.0㎕ 5 X MOPS 3.5㎕ formaldehyde10.0㎕ formamide을 넣고 65℃에서 15분간 방치한다.
c. 재빨리 튜브를 얼음위에 넣고 10분간 방치한다.
d. 몇 초간 미세원심 분리기로 원침하여 튜브에 묻어있는 용액을 튜브 밑으로 모은다.
e. 2㎕의 RNA부하 완충액과 ethidium bromide 0.5㎕를 첨가하고 진탕 혼합 후 살짝 원침한다.
3) 한천 겔의 준비 및 전기영동
a. 1 x formaldehyde 전기영동 겔 완충액으로 전기영동기의 수조를 가득 채우고 이미 만든 겔을 올려 놓는다. 전기영동 완충액이 겔 위로 넘칠 정도로 채운다.
b. 검체를 well에 넣기 전에 5volts/cm로 가동시킨다.
c. 검체를 각 well에 넣은 후 RNA크기 표지자를 첫번째 well에 넣은 후 3-4volts/cm로 가동한다.
d. 1-2시간 간격으로 수조 양쪽의 완충액을 교환해 주거나, 겔의 방향과 함께 극성을 바꿔 준다.
e. bromophenol blue dye가 약 8cm정도 이동했을 때 전기 영동을 끝낸다.
f. 겔을 자외선 투사기 위에 놓고 카메라로 촬영하여 오렌지 색깔의 28S 와 18S의 띠를 확인한다.
4) 전이
a. 겔의 formaldehyde를 제거하기 위해서 DEPC처리한 탈이온수로 수 차례 세척한다.
b. 한천 겔이 1% 이상이거나, 두께가 0.5cm 이상이거나, 분석하고자 하는 전령 RNA의 크기가 2.5kb 이상일 경우 0.05 N NaOH 용액에 20분간 담가서 RNA를 부분적으로 가수분해시켜 전이를 용이하게 한다.
c. 다시 DEPC 처리한 탈이온수로 세척하고 20 x SSC 용액에 45분간 담군다.
d. 흡착지는 DEPC처리한 탈이온수로 충분히 적시고 20 x SSC용액에 5분 이상 담군다.
e. 20 x SSC용액하에서 전이를 시작한다. 전이하는 방법은 써던 블롯팅과 동일하다.
f. 전이는 6-18시간 이상 충분히 한다.
g. 전이가 끝난 후 흡착지를 6 x SSC 용액에 5분간 담가서 흡착지에 묻어있는 겔 조각를 제거한다.
h. 상온에서 30분간 말린다.
i. 흡착지를 3MM지 사이에 두고 진공 오븐에서 80℃로 30분-2시간 정도 굽는다.
j. 흡착지를 바로 사용하지 않을 경우 알루미늄 호일에 싸서 실온에 진공상태에서 보관한다.
5) 보합결합
a. 흡착지를 비닐주머니에 넣고 전보결합 용액을 넣는다.
b. 공기를 제거하고 봉지를 봉하여 42℃ 수조에서 12시간 이상 방치한다.
c. 전보결합 용액을 제거하고 보합결합 용액을 넣고 42℃ 수조에서 16-24시간 동안 방치한다.
d. 비닐주머니에서 흡착지를 꺼내 1 X SSC, 0.1% SDS용액으로 실온에서 20분간 세척한다. 세척 후 가이거 계측기로 흡착지의 방사능을 점검하여 세척이 잘 안되었을 경우 좀 더 높은 온도에서 2 X SSC, 0.1% SDS 용액으로 세척한다.
e. 중감지가 장착된 카세트에 흡착지와 X-선 필름을 2장을 넣고 -70℃에서 자가방사 기록을 한다.
f. 12-24시간내에 우선 필름 한 장을 현상하여 감광 정도를 확인하고 적절한 감광시간을 결정한다.
써던 불롯팅이 DNA를 다루는 작업인 반면에 노던 블롯팅은 RNA를 다루는 기술이다. 노던
블롯팅은 우선 원하는 세포나 조직에서 RNA를 추출해서 RNA의 크기별로 한천 겔에서 전기영동을 통하여 분리하게 된다. 이것을 다루기 쉬운 nitrocellulose 흡착지나 nylon흡착지에 옮긴 후 원하는 보합결합시킨 후 자가방사기록함으로써 원하는 전령 RNA의 크기와 상대적인 양을 측정하는 것이다.
2. 용도
모든 단백이 만들어지기 위해서는 우선 그 단백의 유전자로부터 전령 RNA가 만들어져야 한다.
이것을 전사라고 하며, 노던 블롯팅은 전사된 전령 RNA의 크기와 양을 분석하는데 쓰이게 된다.
3. 방법
노던 블롯팅은 RNA를 분석하는 가장 일반화된 방법이라고 할 수 있다. 원리는 DNA를 분석하는 써던 블롯팅과 아주 유사하다. 조직이나 세포에서 RNA를 분리하는 방법은 여러가지가 있으나 가장 중요한 점은 그 실험실에서 가장 익숙한 방법을 사용하는 것이다. 많은 실험실에서는 cesium chloride 원심분리법을 주로 사용한다. RNA를 추출하는 것은 DNA를 추출하는 것 보다 상당히 까다롭다. RNA는 단일쇄 구조로 되어 있어서 RNA 분해효소(RNase)에 의해 쉽게 분해되며 또한 RNA 분해효소는 상당히 안정하고 조효소가 없어도 활성화 된다는 것이다. 따라서 RNA를 분해 되지 않도록 분리하는 것이 노던 블롯팅의 가장 중요한 과정이라고 할 수 있다. 그러므로 시약이나 초자기구를 RNA 분해효소에 오염되지 않게 준비하는 것이 성공하는 비결이라고 할 수 있다.
4. 실험절차
1) 조직 또는 배양세포에서의 RNA분리
a. 조직을 채취하여 PBS로 세척 후 guanidinium isothiocyanate용액을 조직 1g당 5배 비율로 섞은 후 신속하게 액체 질소에 동결 시킨다. 배양세포의 경우 75㎠ 플라스크당 1ml의 위 용액을 넣어 rubber policeman으로 긁어 낸다.
b. Polytron조직 균질기로 조직을 균질화 시킨다. 이 때에는 반드시 얼음 위에서 균질화 시킨다.
c. 5분간 1,500g에서 원심분리하여 조직의 덩어리등을 제거한다.
d. 상층액을 따서 18게이지 바늘로 10회 정도 흡입과 토출을 시행한다.
e. 20분간 5,000g에서 원심분리하여 상층액만 얻는다.
f. Polyallomer 튜브에 cesium chloride로 쿠션을 만들고 그 위에 상층액을 얹어 놓는다.
g. 원심분리를 하게 되면 RNA는 튜브 밑바닥에 압착결정을 형성하게 된다. 따라서 상층액을 주의해서 따라내고 Kimwipe를 말아서 튜브에 넣고 벽에 붙은 CsCl용액을 제거하고 나머지는 튜브를 Kimwipe위에 1시간 정도 거꾸로 세워 제거한다.
h. 200㎕의 TES완충액을 각가의 튜브 밑바닥에 넣고 가끔 흔들어 주면서 실온에서 약 30-60분간 방치하고 Eppendorf튜브에 옮긴다.
i. 400㎕의 phenol/chloroform 1:1용액을 각각의 튜브에 넣고 진탕 혼합하여 2분간 실온에서 원침한다.
j. 상층액을 따서 다른 튜브에 옮기고 40㎕ 3M sodium acetate와 1ml의 100% 에탄올을 첨가하고 -20℃에서 12시간 이상 방치한다.
k. 10분간 4℃에서 원침하여 RNA압착결정을 얻는다.
l. 70% 에탄올로 세척하고 진공 건조 시킨다.
m. 건조된 RNA압착결정에 DEPC처리된 탈이온수를 넣어 녹인다.
n. 녹인 RNA는 분광광도계로 광학밀도를 재서 농도를 측정한다.
2) 전기영동을 위한 RNA검체 처리
a. 10-20㎍의 RNA를 취하여 진공건조 시킨다.
b. 한 검체당 2.5㎕ DEPC 처리된 증류수 4.0㎕ 5 X MOPS 3.5㎕ formaldehyde10.0㎕ formamide을 넣고 65℃에서 15분간 방치한다.
c. 재빨리 튜브를 얼음위에 넣고 10분간 방치한다.
d. 몇 초간 미세원심 분리기로 원침하여 튜브에 묻어있는 용액을 튜브 밑으로 모은다.
e. 2㎕의 RNA부하 완충액과 ethidium bromide 0.5㎕를 첨가하고 진탕 혼합 후 살짝 원침한다.
3) 한천 겔의 준비 및 전기영동
a. 1 x formaldehyde 전기영동 겔 완충액으로 전기영동기의 수조를 가득 채우고 이미 만든 겔을 올려 놓는다. 전기영동 완충액이 겔 위로 넘칠 정도로 채운다.
b. 검체를 well에 넣기 전에 5volts/cm로 가동시킨다.
c. 검체를 각 well에 넣은 후 RNA크기 표지자를 첫번째 well에 넣은 후 3-4volts/cm로 가동한다.
d. 1-2시간 간격으로 수조 양쪽의 완충액을 교환해 주거나, 겔의 방향과 함께 극성을 바꿔 준다.
e. bromophenol blue dye가 약 8cm정도 이동했을 때 전기 영동을 끝낸다.
f. 겔을 자외선 투사기 위에 놓고 카메라로 촬영하여 오렌지 색깔의 28S 와 18S의 띠를 확인한다.
4) 전이
a. 겔의 formaldehyde를 제거하기 위해서 DEPC처리한 탈이온수로 수 차례 세척한다.
b. 한천 겔이 1% 이상이거나, 두께가 0.5cm 이상이거나, 분석하고자 하는 전령 RNA의 크기가 2.5kb 이상일 경우 0.05 N NaOH 용액에 20분간 담가서 RNA를 부분적으로 가수분해시켜 전이를 용이하게 한다.
c. 다시 DEPC 처리한 탈이온수로 세척하고 20 x SSC 용액에 45분간 담군다.
d. 흡착지는 DEPC처리한 탈이온수로 충분히 적시고 20 x SSC용액에 5분 이상 담군다.
e. 20 x SSC용액하에서 전이를 시작한다. 전이하는 방법은 써던 블롯팅과 동일하다.
f. 전이는 6-18시간 이상 충분히 한다.
g. 전이가 끝난 후 흡착지를 6 x SSC 용액에 5분간 담가서 흡착지에 묻어있는 겔 조각를 제거한다.
h. 상온에서 30분간 말린다.
i. 흡착지를 3MM지 사이에 두고 진공 오븐에서 80℃로 30분-2시간 정도 굽는다.
j. 흡착지를 바로 사용하지 않을 경우 알루미늄 호일에 싸서 실온에 진공상태에서 보관한다.
5) 보합결합
a. 흡착지를 비닐주머니에 넣고 전보결합 용액을 넣는다.
b. 공기를 제거하고 봉지를 봉하여 42℃ 수조에서 12시간 이상 방치한다.
c. 전보결합 용액을 제거하고 보합결합 용액을 넣고 42℃ 수조에서 16-24시간 동안 방치한다.
d. 비닐주머니에서 흡착지를 꺼내 1 X SSC, 0.1% SDS용액으로 실온에서 20분간 세척한다. 세척 후 가이거 계측기로 흡착지의 방사능을 점검하여 세척이 잘 안되었을 경우 좀 더 높은 온도에서 2 X SSC, 0.1% SDS 용액으로 세척한다.
e. 중감지가 장착된 카세트에 흡착지와 X-선 필름을 2장을 넣고 -70℃에서 자가방사 기록을 한다.
f. 12-24시간내에 우선 필름 한 장을 현상하여 감광 정도를 확인하고 적절한 감광시간을 결정한다.
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