§1. 서론
고등식물은 모두 각기 다른 고유의 염색체 수를 가지고 있다. 염색체의 수는 감수분열(meiosis)에 의해서 반으로 줄고 이것은 암과 수의 배우자가 수정으로 결합되어 다시 염색체가 倍加되어 본래의 염색체 수와 동일하게 된다(참고 1,2).
그러나 이러한 수정없이 각각의 배우체가 식물체로 되는 경우가 있다. 암배우체에서 식물체로 되는 것을 處女生植 (parthenogenesis) 또는 雌性(核)單位生殖(gynogenesis)라고 하고 수배우체가 식물체로 되는 것은 童貞生殖(anthrogenesis)이라고 한다. 자연상태하에서는 아주 낮은 빈도(0.001∼0.01%)로 반수체가 나타나지만 조직배양에서는 n상태의 부분만을 배양함으로써 반수체를 다량으로 생산할 수 있다.
반수체를 생산하는 것은 突然變異(mutation)의 유기나 相同(homozygous)의 식물체를 생산해 낼 수 있는 수단이 되기 때문에 농업적으로 큰 의의를 지닌다 하겠다.
§2. 반수체 식물의 육종적 이용
1. 동형접합체의 생산
반수체를 생산하여 염색체를 배가시키면 가장 빠른 방법으로 동형접합체(homogote) 를 유기할 수 있다. 즉, 이형접합체는 후대에 계속 변이를 하므로 이를 동형 접합체로 만들기 위해서는 5∼7세대동안 자가수분을 계속하여야 한다.
2. 육종연한의 단축
수목류와 과수는 초본성 식물과는 달리 ①생식주기가 길고 ②타가수정을 하므로 고도의 이형접합성이며 ③키가 커서 포장 실험에 많은 면적을 차지하는 등의 특성을 가지고 있기 때문에 유전자를 고정하기가 상당히 어렵다. 또한 유용한 특성을 가진 품종을 만들기 위하여 교잡하였을 때 이들 세대간의 연수가 길 뿐 아니라 선발을 위해서 여러 세대를 경과해야 되기 때문에 하나의 고정된 품종이 나오기 까지는 많은 시간이 걸린다.
3. 웅성식물체의 생산
아스파라거스(Asparagus officinalis)는 자성(XX)과 웅성(YY)으로 구분되어 있다. 웅성식물체는 자성에 비하여 조숙이고 생산성이 높다. 따라서 웅성식물체만을 생산하기 위해서 X나 Y의 반수체로 만들어 이중 Y염색체를 배가하여 YY인 식물체를 만들고 이를 영양번식하여 이용하면 된다. 또는 각각의 염색체를 배가하여 XX또는 YY로 만든 다음 이들을 교잡하여 XY의 웅성식물체를 생산하는 방법이 있다.
4. 체세포 잡종
원형질체 융합을 이용하여 체세포 잡종을 만드는 데는 2배체의 원형질체보다 반수체의 원형질체를 이용하여 이들간에 융합시키는 것이 좋다.
5. 돌연변이체의 생산
게놈성 반수체(monohaploid)는 열성돌연변이를 쉽게 식별할 수 있어 반수체 세포에 대규모로 돌연변이를 유발시키고 원하는 형질을 선발할 수 있다. 또한 반수체 세포에서 돌연변이를 유발시키면 chimera를 피할 수 있다.
§3. 반수체 식물의 유도
1. 생체에서 반수체의 유도
식물의 육종에서는 반수체를 이용하기 위하여 자연상태에서 자발적으로 일어나는 반수체를 찾거나 인위적으로 이들을 만들려고 많은 노력을 하였다. 그 중 생체에서 반수체를 생산하는 방법은 다음과 같다.
1-1. 자성단위 생식(雌性單位生殖, gynogenesis)
▷ 자연상태에서는 원연간 교잡 특히 속간교잡에서 나타난다.
▷ 인위적인 방법으로는 방사선을 조사에 의하여 불임이 된 화분은 수분시키면 자성배우체만이 성장하여 반수체가 형성된다.
1-2. 웅성단위생식 (雄性單位生殖)
수정 전에 난세포의 핵이 제거되거나 비활성되어 화분의 핵만을 가진 난세포가 발달함으로써 반수체 개체가 생산된다.
1-3. 게놈의 배제
극히 일부의 종간과 속간 잡종에서 나타나는 현상으로 수정 후에 genome 하나가 배제되어 하나의 genome만이 있는 배가 발생하여 반수체가 된다. 예를 들면 보리(Hordeum vulgare)와 보리(H. bulbosum)사이의 종간잡종에서는 반수체가 생산된다.
1-4. 반결합(半結合, semigamy)
난세포의 핵과 발아된 화분의 핵이 각각 반수체 키메라를 만드는 경우가 있다.
1-5. 화학물질 처리
화학물질을 처리하여 어느 한 쪽의 배우체 염색체가 배재된다면 인위적으로 반수체의 출현을 유도할 수 있다. 이러한 물질로는 toluen blue, maleic hydrazide, nitrous oxicle, colchicine, chloramphenicol 및 parafluorphenylalanine 등이 있다.
2. 기내에서 반수체의 유도
기내에서 자성배우체(female gamete)와 웅성 배우체(male gamete)를 자극해서 반수체를 유도할 수 있다. 생체에서 반수체 생산은 대부분 난세포나 조세포가 자극을 받아 수정되거나 수정되지 않고 자라는 자성단위생식에 의해서 이루어 진다. 그러나 기내에서는 반수체의 유도는 주로 반수체 세포로부터 직접 기내에서 반수체를 생산하거나 또는 생체에서와 같이 반수체 생산방법은 유사하나 반수체 생산 과정이 기내에서 이루어 진다.
2-1. 기내에서 반수체의 유도 종류
(1) 약배양(葯培養, anther culture)
화분이 들어 있는 약을 식물체에서 분리하여 배양하는 것으로 다음의 절에서 논의될 것이다.
(2) 화분배양(花粉培養, pollen culture)
화분배양은 약에서 체세포 조직을 제거하고 소포자(小胞子)만을 분리하여 배양하는 것으로 다음 절에서 논의 될 것이다.
(3) 배배양(胚培養, embryo culture)
3절의 1-3과 유사한 것으로 보리(Hordeum vulgare)와 보리(H. bulbosum)를 교잡하거나 밀(Triticum aestivum)과 밀(H. bulbosum)을 교잡하여 배배양을 하는 것이다.
(4) 배주배양(胚珠培養, ovule culture)
수정되지 않은 배주를 배양하는 방법이다(보리, 거베라, 페튜니아에서 반수체식물이 생산되었음).
(5) 기타
배우체(配偶, gametophyte)에 방사선 등을 조사(照射)하여 자방배양 등의 방법을 통해서 반수체를 유도할 수 있다. 예를 들면 폐튜니아의 수술에 방사선을 조사하여 정상인 폐튜니아에 이를 수분시킨 후 자방배양을 하면 기내에서 반수체 식물을 유도할 수 있다.
1. 약배양
약(葯)은 화기 중에서 수술대의 끝에 달린 수생기관이다. 약배양에 이용되는 부분은 약이지만 실제는 화분 또는 화분의 초기발육 상태인 소포자들이다.
약배양은 화분립을 배양하는 것보다 식물체로의 재생은 쉽지만 약벽을 구성하고 있는 2n조직이 재생될 가능성이 있고 캘러스가 형성될 가능성도 높아 순수한 2배체의 획득율이 화분립이나 소포자 배양에서 보다는 낮다.
1-1. 공여식물체의 생장환경
약은 모체의 영향을 많이 받는 바 식물체의 연령과 생육환경에 따라 약배양의 성공여부가 결정된다.
연령은 어린 식물체일수록 재생율이 높고 같은 개체내에서도 일찍 출현된 가지가 나중에 나온 것보다 좋다. 모체는 온도, 광성 및 습도 등의 환경이 조절되는 곳에서 재배할 때 재현성 있는 결과를 얻을 수 있다.
일장에 따라서도 반응에 차이가 있다. 담배나 유채는 8사간의 단일하에서 재배된 식물체에서 재생률이 높다. 또한 질소 시용량에 따라서도 차이가 있는 바 담배는 질소질 비료를 충분하게 시용한 것보다 부족하게 준 식물체의 약에서 재생률이 높았다.
1-2. 인자형의 선택
약배양은 재료의 인자형에 따라 재생률에 차이가 있다. 즉, 같은 종내의 품종은 물론 계통간에도 반응의 차이가 있다. 밀의 25개 품종을 가지고 실험간 결과에 따르면 겨울밀은 봄밀보다 약배양이 잘되며 변이성도 크고 밀과 호밀의 교잡종이 약배양이 가장 잘된다고 한다. 꽃양배추의 약배양에서는 품종간에 차이가 있을 뿐만 아니라 배지간에도 유의성 있는 차이가 있음이 보고되었고 하계종보다 동계종의 반응이 더 우수하다고 한다.
1-3. 약의 분리시기
약배양시 약을 분리하는 시기가 중요하다. 대부분의 연구 결과에서 나타난 분리시기는 핵이 4분자기(tetrad)기 이후에서부터 제1화분립 유사 분열기(A,B) 사이의 단핵소포자기(單核小胞子期)임이 밝혀졌다. 즉, 4분자로부터 방출되는 시기와 제1화분집 유사분열기 사이게 있는 단핵소포자기의 상태의 약을 분리하였을 때가 약배양의 적기이다.
정확한 발육단계는 현미경을 이용하거나 형태적인 특성을 기준으로 판단할 수 있다. 담배에서 꽃봉오리 채취시기는 꽃잎이 바로 보일때가 가장 좋다. 배추에서는 꽃잎이 수술의 1/2일 때가 적기이다.
1-4. 전처리
전처리는 화분의 배형성을 촉진시키기 위하여 배양 전에 가해지는 자극으로서 저온, 고온, 원심분리, 강압 등의 처리가 있다. 이 중에 가장 효과가 큰 것은 저온처리이다.
저온처리의 온도범위와 기간은 종에 따라 다르다. 중요한 점은 처리시기가 화분의 발육단계와 맞추어 이루어져야 한다는 것이다. 처리방법은 줄기의 기부를 잘라 물병에 꽂거나 꽃봉오리에 식물체의 일부를 붙여 비닐백이나 foil에 싸서 4∼10℃에 둔다. 처리기간은 1∼30일 사이이다.
1-5. 접종 및 배양
일반적으로 꽃봉오리를 sodium hypochlorite 0.5∼1%액에 10∼15분간 표면살균하고 증류수로 3회 세척한 다음 멸균수로 3회정도 세척한 다음 이로부터 약을 분리한다. 약 분리시 이때 약에 손상이 가지 않도록 조심해야 한다.
약배양은 접종 후 온도나 일장에 영향을 받는데 온도는 30∼35℃이고 처리기간은 1일에서부처 30∼40일까지 다양하다. 온도처리 이후에는 20∼25℃로 낮추어 배양한다. 일장은 식물에 따라 크게 차이가 있으나 배발생시에는 조명을 해주어야 한다.
화분(pollen grain)은 성숙된 약으로부터 분산되기 전후의 상태를 의미한다. 화분배양시 일반적으로 성숙된 화분보다 화분 발생초기의 소포자(microspore)상태의 화분을 이용하므로 소포자배양이라고도 표현하고 있다. 그러나 어느정도 성숙된 화분을 이용하는 경우도 있으므로 소포자배양과 화분배양을 구분하여야 될 것이다. 화분배양(pollen culture)은 약안에 있는 화분을 꺼내어 접종하는 것이다.
2-1. 화분 또는 소포자배양의 장점
화분 또는 소포자배양이 약배양에 비하여 여러 가지 장점이 있다.
▷ 화분 또는 소포자 배양은 체세포에서 유래된 2배체가 형성될 기회가 현저히 감소한다.
▷ 양분이 배지로부터 화분으로 직접 이동된다.
▷ 약에서 분비되는 물질이 없어 독성물질 또는 억제물질 등이 문제시 되지 않는다.
▷ 화분에서 직접 배로 분화될 수 있고 배형성율이 약배양에서 보다 높다.
▷ 약보다는 화분립이 돌연변이 연구와 유전적인 조작을 위한 시발재료로 더 적합하다.
2-2. 화분배양 방법
약으로부터 화분을 분리하는 방법은 앞에서 그림으로 설명되었다. 자세한 설명은 실습시간에 설명될 것이어서 여기서는 생략하고자 한다.
배양에 이용되는 배지는 고체 또는 액체배지에서 모두 가능하다. 당분의 농도는 일반적으로 2∼4%이지만 배추 등에서처럼 10%인 것도 있다. Mineral의 요구도는 일반적으로 MS배지나 Nitsch의 대량염류배지가 흔히 사용된다. 약으로부터 방출되는 독성물질 등을 제거하고자 activated charcoal이 이용되기도 한다.
2-3. 소포자의 분열
약이나 화분을 배지에 접종하면 이 중에서 반응을 나타내어 일부는 소포자가 세포분열을 하여 다세포가 되어 화분배를 형성한다.
소포자의 일반적(정상적)인 분열형태는 그림에서 in vivo와 같이 비대칭분열(非對稱分裂, asymetric division)이고 분열 후에는 생식세포와 영양세포(생식세포보다 크다)가 생긴다. 생식세포는 처음에 화분립의 내막에 붙어있다가 마침내는 영양세포질 속에 나타나서 분열을 계속하지만 영양세포는 그대로 있다.
그러나 in vitro 에서는 위에서의 정상세포(in vivo)와는 그림과 같이 3∼4가지
경로로 이루어진다. 3가지 경로에서는 제1차 화분 유사분열에 의해서 두 개의 대칭적인 영양핵이나 생식핵이 형성된다. ①제1차 화분 유사분열 후 형성된 비대칭적인 2개의 핵(영양핵, 생식핵)중 영양핵만이 분열하고 생식핵은 퇴화된 후 반수체의 배가 형성되는 경우 ②①과 유사하나 생식핵의 퇴화됨 없이 영양핵만이 분열하여 반수체배가 형성되는 경우 ③②와 유사하게 분열하는 것으로 생식핵만이 분열하여 반수체배가 형성되는 경우가 있다.
4가지 경로에서는 3가지 경로에 한 가지를 더 추가하여 영양세포와 생식세포가 모두 분열하여 반수체 배를 형성하는 것으로 현재까지 독말풀에서만 발견되었다.
이상과 같이 반수체배가 형성되는 경로가 다양하다. 따라서 화분으로부터 유래된 반수체 식물은 서로 동일하지 않을 수 있다.
2-4. 다세포 화분의 분화
위의 4가지 경로 중 어떤 방법으로든지 분열을 하여 다세포로 된 화분립은 다음 2가지 경로로 반수체 식물체가 된다.
(1) 직접 웅성 단위생식
이것은 1개의 화분립이 1개의 식물체만을 만드는 화분-배-식물체의 과정이므로 접합체배발생과 유사하다. 구상기(globular stage)에서 화분벽이 파열되어 심장형기, 어뢰형기 및 자엽기를 거쳐 식물체가 된다.
예) 대부분의 십자화과와 감자과 식물
(2) 간접 웅성 단위생식
이 경우는 화분-캘러스-식물체로서 주로 구상기에 무질서하게 형성된 캘러스가 약벽을 통해 터져 나오는 것이다. 이러한 원인은 배지내의 생장조절제 등에 의해서 극성이 파괴되기 때문에 볼 수 있다.