물추출물은 여러 고분자 물질들을 포함한 상당히 다양한 물질류들이 들어있습니다.
따라서, 다른 여러 크로마토그래피법의 실험들을 진행하기 전에,
추출물들을 다른 방법으로 분획을 해주어야 실험을 진행하기가 쉽습니다.
단백질류, 다당류, 단당류, 여러 유리아미노산, 유기산 등등등,,,
이들는 대략적으로 분획할 수 있는 쉽게 사용할 수 있는 몇가지 방법들을 소개합니다.
== 용매분획법
추출물을 물에 녹인후, 물과 섞이지 않는 같은 양의 유기 용매를 넣어서, 분액깔대기에서 분획하는 방법입니다.
보통 사용하는 용매는 극성도 순으로, 헥산, 디클로로메탄, 에칠아세테이트, 부탄올 등이 있습니다.
본실험의 경우, 물추출물이므로, 일단은 부탄올과 물로 분획을 시도해 보면 좋을 듯합니다. 물추출물을 부탄올로, 5회가량 추출해 내는데, 부탄올층이 거의 색이 없을 때 까지 추출하는것이 좋습니다.
처음에 소량을 가지고, 물층과 부탄올층으로 분리를 해보고, 이때 만일에, 두층사이에, 녹지않는 물질층이 많이 생기는 경우는, 비극성도가 좀더 높은 용매부터 시작하는 것도 좋습니다. 예를 들면, 에칠아세테이트...
용매분획법에는 시료에 따라서, 용액의 산도를 조절하면, 또 여러 이온물질들을 분획해 낼 수가 있습니다. 예를 들면 COOH기가 있는 여러 유기산들과, 페놀산들의 경우는 알칼리용액에서는 물층으로 이동하고, 산성용액에서는 유기용매층(부탄올...)으로 이동합니다.
== Dialysis Membrane
삼투압을 이용하는 방법입니다.
분자량이 큰 고분자 물질들과 저분자 물질들을 분리할 수 있습니다.
적당한 크기의 membrane 주머니에, 물추출물 용액을 넣고, 밀봉한뒤 이것을
다른 증류수가 든 통에 넣어두면, 저분자 물질들은 밖으로, 나오게 되고,
고문자 물질들은 그안에 그대로 남게 됩니다.
membrane를 분자량 크기에 따라 선택할 수 있습니다.
예를 들면, MW2000막을 사용하면, 분자량 2000 이상의 고분자 물질들과 2000 이하의 물질들을 분획할 수 있습니다.
이렇게 분획을 하여서, 활성이 고분자에 있는지 저분자에 있는지 먼저 확인을 하고, 실험을 진행하면, 많은 시간과 경비를 절약할 수 있습니다.
왜냐하면, 보통, 고분자 물질와 저분자 물질의 분리 실험은 그방법이 아주 다양하기 때문에, 미리 이런 식으로 분리를 하는 것이 유익합니다.
만일 당류가 활성물질이라면, 그 당이 단당류인지 아니면 다당류인지먼저 구분하는 것이 필요합니다.
=== 유기용매를 이용한 침전법.
물추출물의 서로다른 용매에 대한 용해도를 이용하는 방법인데, 아주 단순한 방법이지만 아주 효율적입니다.
단백질 부분이나, 고분자 물질들을 제거해내거나 분리할 때 많이 사용합니다.
일단 소량의 시료를 가지고, 어떤 용매가 적절한지 실험해보면 좋습니다.
아세톤, 메탄올, 에테르 등
방법.
물추출물을 최소한의 물을 사용하여 완전히 녹입니다.
곧 거의 포화된 수용액을 만듭니다.
이것을 유기용매가 든 통에 한방울씩 떨어뜨리면서, 저어줍니다.
그러면, 이 수용액이 유기용매속에 떨어지면서, 침전물을 형성합니다.
(이때 떨어뜨리는 수용액의 총부피는 유기용매의 총부피의 20퍼센트를 넘지 않아야 합니다.)
이 침전물을 용액과 분리를 하면 됩니다.
보통 원심분리기를 사용하면, 침전물이 가라않고, 위의 용액을 따라내면 됩니다.
필터페이퍼를 사용해서, 침전물을 걸러내는 것도 한방법입니다.
사용하는 용매에 따라서, 침전되는 물질의 양과 종류가 다릅니다.
따라서, 소량의 시료로 실험해보는 것이 좋습니다.
미지의 물질들이라면, 우선, 반반정도로, 분리시키는 용매도 좋을 듯합니다.
또한, 침전된 침전물을 다시 물에 녹여서, 다른 용매로, 침전을 시키는 방법을 통해서, 재분획을 할 수도 있습니다.
보통 아세톤을 사용하면, 단백질 류들은 침전되고, 다른 당류나, 유리산 아미노산류들은 용액속에 남아있습니다.
==================================
물 추출물에서 활성이 나왔고, 그리고, 그 활성물질이 무엇인지 전혀 알지 못한다면,,,,
저라면, 다음과 같은 방법을 우선 해보겠습니다.
우선,
에칠아세테이트로, 물층을 반복해서, 추출하고(추출한 에칠아세테이트 층이 색이 없어질때까지 반복)
, 다시 물층을 n-부탄올로 반복해서 추출합니다.
(여기서 만일에, 에칠아세테이트 분획의 양이 수율이 2퍼센트이하로, 아주 적다면, 에칠아세테이트 분획을 하지 않고, 바로, 부탄올과 분획만해도 됩니다.)
이렇게 하면, 세개의 분획이 얻어집니다.
에칠아세테이트 분획
부탄올 분획
물분획
각분획을 건조시켜 용매를 제거시킨뒤 활성을 측정하여, 활성이 어디에 있는지 측정합니다.
만일에 위의 실험에서, 물 분획에 활성이 있다는 결과가 나오면, 그때, 그 물분획을 삼투막을 사용하거나, 용매 침전법을 사용해서,
분자와 저분자의 물질로 또는 단백질류와 당류, 저분자물질들 등의 분획을 나누고, 다시 활성을 측정합니다.
....
그 다음의 단계는 많이 알고 있는 여러 종류의 크로마토그래피 법을 사용하여 물질들을 순수분리합니다.
실리카젤을 이용하는 방법은 정말로, 물층에만 있는 극성도가 높은 물질은 사용하기 어렵습니다.
물층에만 있는 극성도가 높은 당류를 분리하고자 한다면,
- Sephadex G series 칼럼,
- 당만을 분리할 수 있는 당분리용 전용 칼럼물질류...
- C18같은 비극성 칼럼.
위와 같은 방법들을 추천합니다.
그리고, 분리방법은,
- prep HPLC : 해상도가 높으나, 기계가 있어야함.
- prep TLC : 아주 간단히 할 수 있음. 꼭 prep TLC가 아니더라도, Analytic TLC plate로도, 소량의 물질들은 분리할 수 있음.
- Open Column : 대량의 물질을 분리할 수 있으나, 시간이 소요됨. 용매선택을 잘해야함.
새해에 연구에 있어서, 좋은 결과들이 많이 있기를 바람니다.
그럼...
따라서, 다른 여러 크로마토그래피법의 실험들을 진행하기 전에,
추출물들을 다른 방법으로 분획을 해주어야 실험을 진행하기가 쉽습니다.
단백질류, 다당류, 단당류, 여러 유리아미노산, 유기산 등등등,,,
이들는 대략적으로 분획할 수 있는 쉽게 사용할 수 있는 몇가지 방법들을 소개합니다.
== 용매분획법
추출물을 물에 녹인후, 물과 섞이지 않는 같은 양의 유기 용매를 넣어서, 분액깔대기에서 분획하는 방법입니다.
보통 사용하는 용매는 극성도 순으로, 헥산, 디클로로메탄, 에칠아세테이트, 부탄올 등이 있습니다.
본실험의 경우, 물추출물이므로, 일단은 부탄올과 물로 분획을 시도해 보면 좋을 듯합니다. 물추출물을 부탄올로, 5회가량 추출해 내는데, 부탄올층이 거의 색이 없을 때 까지 추출하는것이 좋습니다.
처음에 소량을 가지고, 물층과 부탄올층으로 분리를 해보고, 이때 만일에, 두층사이에, 녹지않는 물질층이 많이 생기는 경우는, 비극성도가 좀더 높은 용매부터 시작하는 것도 좋습니다. 예를 들면, 에칠아세테이트...
용매분획법에는 시료에 따라서, 용액의 산도를 조절하면, 또 여러 이온물질들을 분획해 낼 수가 있습니다. 예를 들면 COOH기가 있는 여러 유기산들과, 페놀산들의 경우는 알칼리용액에서는 물층으로 이동하고, 산성용액에서는 유기용매층(부탄올...)으로 이동합니다.
== Dialysis Membrane
삼투압을 이용하는 방법입니다.
분자량이 큰 고분자 물질들과 저분자 물질들을 분리할 수 있습니다.
적당한 크기의 membrane 주머니에, 물추출물 용액을 넣고, 밀봉한뒤 이것을
다른 증류수가 든 통에 넣어두면, 저분자 물질들은 밖으로, 나오게 되고,
고문자 물질들은 그안에 그대로 남게 됩니다.
membrane를 분자량 크기에 따라 선택할 수 있습니다.
예를 들면, MW2000막을 사용하면, 분자량 2000 이상의 고분자 물질들과 2000 이하의 물질들을 분획할 수 있습니다.
이렇게 분획을 하여서, 활성이 고분자에 있는지 저분자에 있는지 먼저 확인을 하고, 실험을 진행하면, 많은 시간과 경비를 절약할 수 있습니다.
왜냐하면, 보통, 고분자 물질와 저분자 물질의 분리 실험은 그방법이 아주 다양하기 때문에, 미리 이런 식으로 분리를 하는 것이 유익합니다.
만일 당류가 활성물질이라면, 그 당이 단당류인지 아니면 다당류인지먼저 구분하는 것이 필요합니다.
=== 유기용매를 이용한 침전법.
물추출물의 서로다른 용매에 대한 용해도를 이용하는 방법인데, 아주 단순한 방법이지만 아주 효율적입니다.
단백질 부분이나, 고분자 물질들을 제거해내거나 분리할 때 많이 사용합니다.
일단 소량의 시료를 가지고, 어떤 용매가 적절한지 실험해보면 좋습니다.
아세톤, 메탄올, 에테르 등
방법.
물추출물을 최소한의 물을 사용하여 완전히 녹입니다.
곧 거의 포화된 수용액을 만듭니다.
이것을 유기용매가 든 통에 한방울씩 떨어뜨리면서, 저어줍니다.
그러면, 이 수용액이 유기용매속에 떨어지면서, 침전물을 형성합니다.
(이때 떨어뜨리는 수용액의 총부피는 유기용매의 총부피의 20퍼센트를 넘지 않아야 합니다.)
이 침전물을 용액과 분리를 하면 됩니다.
보통 원심분리기를 사용하면, 침전물이 가라않고, 위의 용액을 따라내면 됩니다.
필터페이퍼를 사용해서, 침전물을 걸러내는 것도 한방법입니다.
사용하는 용매에 따라서, 침전되는 물질의 양과 종류가 다릅니다.
따라서, 소량의 시료로 실험해보는 것이 좋습니다.
미지의 물질들이라면, 우선, 반반정도로, 분리시키는 용매도 좋을 듯합니다.
또한, 침전된 침전물을 다시 물에 녹여서, 다른 용매로, 침전을 시키는 방법을 통해서, 재분획을 할 수도 있습니다.
보통 아세톤을 사용하면, 단백질 류들은 침전되고, 다른 당류나, 유리산 아미노산류들은 용액속에 남아있습니다.
==================================
물 추출물에서 활성이 나왔고, 그리고, 그 활성물질이 무엇인지 전혀 알지 못한다면,,,,
저라면, 다음과 같은 방법을 우선 해보겠습니다.
우선,
에칠아세테이트로, 물층을 반복해서, 추출하고(추출한 에칠아세테이트 층이 색이 없어질때까지 반복)
, 다시 물층을 n-부탄올로 반복해서 추출합니다.
(여기서 만일에, 에칠아세테이트 분획의 양이 수율이 2퍼센트이하로, 아주 적다면, 에칠아세테이트 분획을 하지 않고, 바로, 부탄올과 분획만해도 됩니다.)
이렇게 하면, 세개의 분획이 얻어집니다.
에칠아세테이트 분획
부탄올 분획
물분획
각분획을 건조시켜 용매를 제거시킨뒤 활성을 측정하여, 활성이 어디에 있는지 측정합니다.
만일에 위의 실험에서, 물 분획에 활성이 있다는 결과가 나오면, 그때, 그 물분획을 삼투막을 사용하거나, 용매 침전법을 사용해서,
분자와 저분자의 물질로 또는 단백질류와 당류, 저분자물질들 등의 분획을 나누고, 다시 활성을 측정합니다.
....
그 다음의 단계는 많이 알고 있는 여러 종류의 크로마토그래피 법을 사용하여 물질들을 순수분리합니다.
실리카젤을 이용하는 방법은 정말로, 물층에만 있는 극성도가 높은 물질은 사용하기 어렵습니다.
물층에만 있는 극성도가 높은 당류를 분리하고자 한다면,
- Sephadex G series 칼럼,
- 당만을 분리할 수 있는 당분리용 전용 칼럼물질류...
- C18같은 비극성 칼럼.
위와 같은 방법들을 추천합니다.
그리고, 분리방법은,
- prep HPLC : 해상도가 높으나, 기계가 있어야함.
- prep TLC : 아주 간단히 할 수 있음. 꼭 prep TLC가 아니더라도, Analytic TLC plate로도, 소량의 물질들은 분리할 수 있음.
- Open Column : 대량의 물질을 분리할 수 있으나, 시간이 소요됨. 용매선택을 잘해야함.
새해에 연구에 있어서, 좋은 결과들이 많이 있기를 바람니다.
그럼...
다음검색