균주의 보관

[이창운]

균주의 보관 항생물질을 생산하는 것으로 나타나는 균주는 보관하여 언제든지 다시 실험에 들어 갈 수 있도록 한다. 균주보관이 잘못된 경우 같은 균주를 얻을 확률이 아주 희박하여 노력하여 구한 목적균주를 놓치는 경우도 있고 균주의 성질이 변화하여 원하는 물질을 얻지 못할 경우도 있다. 따라서 균주를 토양에서부터 스크리닝하는 것도 중요하지만 그에 못지않게 보관 또한 중요하다.
(1) 균주 보존기관
실험에 필요한 순수배양된 균을 입수하거나 기탁하고자 할 때는 국내외의 공인된 미생물 보존기과에 의뢰하여 분양 및 교환한다.
대표적 균주 보존기관은 다음과 같다.

표4-1대표적균주보존기관

기 관 명	소 재 지	국 명	비 고
社團法人 韓國種菌協會	.서울특별시 서대문구 신촌동 연세대학교	한 국	KFCC
日本微生物株保存機關連盟	.日本東京都文京區彌生町 .東京大學應用微生物硏究所內	일 본	JFCC
The American Type  Culture Collection	.12301, Park Drive, Rockville, .Maryland 20852, U.S.A.	미 국	ATCC
.The North Regional .Research Laboratory	.1815, University St. Peoria Iilnois, 61604, U.S.A.	미 국	NRRL
.The National Collection of .Type Culture	.List Institute of Preservation Medicine London, .England	영 국	NCTC
.연세대학교, 공학부, 식품 .공학과, 미생물공학 연구실	.서울특별시 서대문구 신촌동	한 국	YEEM
.Centraalbureau voor .Schimmelcultures	.Javalcan 20, Baarn, Julianalaan 67A Delf, .Netherland	Netherland	CBS
.大坂大學工學部 酵素工學科	.大坂市北區東野田 9丁目	일 본
.財團法人 醱酵硏究所	.大坂市東淀川區十三西町 4-54	일 본	IFO
.財團法人 長尾硏究所	.東京都品川區北品川 6-387	일 본
.東京大學 科學硏究所	.東京都港區芝白金台町 1丁目	일 본	IID

(2) 균주 보존법
실험에 사용하는 균주는 솜 마개(면전)시험관내에 미생물을 한천고형배지 또는 액체배지에 배양하여 정기적으로 계대배양하여 보존한다. 이 방법은 널리 사용되는 가장 기본적인 보존법이지만 생존기간이 짧고 특히 솜 마개를 통하여 보존 중 오염될 우려가 있다. 또한 최대의 결점은 생육하는 균의 노폐물에 의해 형질이 불안정해지거나 균이 변이, 퇴화되는 위험이 크다. 보존장소로는 2-4℃의 냉장고가 적당하며, 위생곤충(쥐, 바퀴벌레. 진드기) 에 주의해야한다.
..1) 동결건조법(Lyophilic preservation)
....① 멸균된 소나 말의 혈청으로 포자 또는 균체의 혼탁액을 만들어 0.05-0.1ml씩 앰플(ample)에 분주한다.
....② 두꺼운 고무관을 앰플에 끼워 진공장치에 연결하여 진공장치에 연결하여 동결건조에 넣고 급히 빙결시킨다.
....③ 동결제로는 dryice-acetone (-40～-50℃)이 쓰인다.
....④ 진공펌프를 작동하여 동결상태에서 진공건조시킨다.
....⑤ 마지막 온도를 30-40℃로 하여 잔존수분을 완전제거하여 진공밀봉한다.

위 방법은 미생물의 장기보존에 사용된다. 세균의 경우 10여년 후 까지 생육이 가능하다 그림4-26 동결건조 앰플
. 동결건조의 장점은 첫째 보존에 사용한 포자가 직접 발아하는 것으로 형태상 또는 생리적 성질의 변함없이 장기간 보존이 가능하며 둘째 잡균의 혼입우려가 전혀 없고 셋째, 저장이 용이하며 방법이 간단하다는 것이다. 사상균, 효모, 세균, 방선균과 phage에 적용된다. 사상균 중 단단하고 작은 포자를 형성하는 것에 이용되지만 Entromophthorales에 속하는 것은 부적당하다. 효모 중에서 Erettanomyces, Saccharomyces, Endomycopsis, Schizosaccharomyces 등은 동결건조하면 생존율이 낮아진다. 세균은 그람음성균에 감수성균이 많다. 그 외 동결건조에 부적당한 균은 액체질소에 의한 동결건조를 이용한다. .....................그림4-26 동결건조 앰플

2) 사면배양 보존법(Slant culture)
사면배지에 접종하여 보존하는 방법이다. 사용배지로는 곰팡이, 효모의 경우 맥아즙, 한천배지, 국즙 한천배지가 상용되며, 세균은 육즙한천배지가 쓰인다. 계대배양을 위한 이식기간은 곰팡이, 세균은 6개월, 효모는 3-6개월마다 행한다.

3) 고층배양법(Stap culture)
주로 혐기성 균의 보존에 사용한다.
그림 4-27 사면평판배양법
4)토양중 보존법
① 풍건한 토양에 물을 가하여 수분이 20%가 되게한다
② 이것을 시험관에 분주한다
③ 120℃에서 3시간 살균하고 2일후 다시 같은 방법으로 살균한다
④ 포자 또는 균사 현탁액 1ml을 가하여 실온에서 보존한다
이방법은 장기보존에 적당하며 곰팡이의 경우는 9년후에도 생육이 가능하다.

5)모래배양법(Sand culture)
① 깨끗한 해사(sea sand)를 알칼리, 산, 물의 순서로 깨끗이 씻는다.
.....................................................................................................그림 4-27 사면평판배양법

② 시험관에 2-3cm정도 넣고 건열멸균한다
③ 배양된 균을 방냉 시킨 위 시험관에 잘 섞고 진공 desiccator에서 완전히 건조시킨다.
④ 시험관을 밀봉 보존한다.
이 방법은 Acetone-butanol균과 같이 건조해서 잘 견디는 세균 또는 곰팡이의 보존에 쓰인다

6) 당액보존법
이 방법은 효모의 보존방법으로 많이 쓰이며 한센(Hansen)씨병, 또는 Freuden reich 씨병에 살균한 10% 설탕액을 넣고 배양된 소량의 효모를 가하여 냉함소에 보관하는 방법으로 10년 이상 보존 가능하다

7) 유동 파라핀 중층법
병원균이 배양되고 있는 시험관에 유동 paraffin을 넣어 균에 산소 공급을 차단하고 균의 대사 활성을 억제시켜 보존하는 것인데, 세균, 방선균, 사상균의 보존에 의용되고 있다. 특히 세균의 보존에 널리 이용되고 있다. 또 사상균에 대해서도 좋은 결과를 나타내고 있다.
사면 혹은 고층배지에 이식하고, 균이 전면에 생장하고 있을 때에 살균한 유동 파라핀을 피펫으로 무균적으로 배양상에 중층을 만든다. 깊이는 사면배지에는 배지의 상단부터, 고층배지에는 배지표면에서 1cm 정도의 높이로 한다. 중층한 후에는 5～10℃가 유지되는 장소에 보존하나, 균의 종류에 따라서는 실온이 알맞는 것도 있다. 보통 1～수년간은 보존할 수 있다.
유동 파라핀은 질이 좋은것(중성, 비중 0.8～0.9)을 택하고 120℃에서 1～2시간 고압 살균한 후 110～170℃에서 1～2시간 건열하여 수분을 증발시킨 후 사용한다.

8) 물 보존법
살균수 속에 세균 혹은 사상균을 현탁시켜서 실온에서 보존하는 것이다. 방선균, 효모, 사상균의 대부분은 증류수로 현탁하여 두면 실온에서 수년간 보존할 수 있다고 보고되어 있다. 널리 쓰이고 있지 않으나 식물의 풋마름병균(Pseudomonas solanacearum)의 보존법에 적용되어 좋은 결과를 얻고 있다.
세균의 사면배지에 6～7㎖의 살균 증류수를 넣고, 잘 분산시켜 현탁액을 만든 후 이것을 살균 시험관(예컨대, 1㎖의 마개가 있는 작은 시험관)에 옮겨 밀봉하고 실온에서 보존한다.

9) 동결보존법
세포를 동결, 대사활동을 정지시켜 세포를 휴지상태로 하여 장기간 보존하는 방법이다. 방법으로는 동결에 의해 형성된 빙정의 상태나 전기적으로 -20℃～-80℃로 온도를 낮추어 하는 것과 액체질소(-196℃) 중 또는 다른 종류의 기상(-150～-170℃)중에서 보존하는 방법이 있다.
① 한천사면배양의 동결보존(-20℃)
선상균, 효모, 방선균을 한천사면에 배양 후 -20℃의 저온에서 보존하며 분산매는 사용하지 않는다. Aluminum 마개 배양튜브(2.5～7.5㎝)내의 한천사면(배지량 3㎖)에 균을 배양하여 포자형성 균주는 포자형성이 시작하는 시기, 또는 포자를 형성하지 않는 균주는 균선의 생육이 왕성한 시기에 배양튜브를 단단히 밀봉한 후 보존한다. 배양이 오래되거나 배지가 부적당하면 보존능이 낮아진다. 2년마다 계대배양을 하면 거의 전 균주를 보존할 수 있다.
Curvularia, Helminthosporium 등은 보존성이 낮다. 방선균(Streptomyes, 포자를 형성하지 않는 균주 포함)의 경우는 screw cap시험관의 한천사면에 배양(14일간)하고, 동결보존하여 1년마다 계대배양하면 전 균주를 유지할 수 있다는 보고도 있다.
동결된 균주를 사용할 때는 실온에 방치하여 해동한 후 사용한다. 해동된 균주를 재동결하면 세포의 생존능이 낮아지므로 한번 해동한 균주는 보존용으로 다시 사용하지 않는 것이 좋다. 보존 중의 온도의 변동(특히 0～-20℃ 사이의 변동은 균주의 사멸을 촉진하므로 보존온도의 관리에 주의하여야 하며 보존 시 용기는 완전히 밀봉하여야 한다.

②세포현탁액의 동결보존(-20℃)
정상기에 달한 배양세포를 적당한 분산매에 현탁하여 밀봉한 다음 -20℃에서 동결보존한다. 세균에 많이 이용한다.

③ 세포현탁액의 동결보존(-70℃)
전 항과 같은 방법으로 만들어진 세포현탁액을 대개는 그대로 또는 한제에 넣어 동결한 후 -70℃ 전후의 온도에 옮긴 후 보존한다.
동결시료 사용 시는 시료를 37～40℃의 온수에 넣어 급속히 해동한 후 사용한다. 이 방법은 세균에 많이 이용하며 분산매로는 스킴밀크를 이용한다.

..................................................................................... 그림 4-28 동결보존을 위한 앰플제조

④ 액체질소에 의한 동결건조
세포를 분산매에 현탁하거나, 한천배양 그대로 액체동결하여 질소(-196℃)중이나, 그
외의 기체상에서 보존한다. 동결건조나 그 밖의 건조처리를 수반하는 보존법의 적용이 곤란한 미생물, 예를 들어 일부세균(Mycoplasma, Leptospira, 수표세균, 해양세균), 배지상에서 포자(단단하고 작은 포자)를 형성하는 선상균, 미세조류, 원생동물, 박테리오 파지의 장기보존법, 또는 직접 Bioassay에 사용하기 위한 접종균의 보존에 이용된다.
분산매로는 10% glycerine, 5～10% dimethyl - sulfoxide((CH3)2SO, DMSO)등을 이용한다. 세포를 급속히 동결하면 세포내에 빙정이 형성되어 생존율을 저하시키는 원인이 되므로 완만동결을 행한다. 즉 강하속도를 매 분 1℃ 전후로 제어하며 시료온도가 -30℃가 될 때까지 동결한 다음 시료를 액체질소 내에 넣어 급격히 온도를 하강시켜 그대로 보존한다. 보존균주를 실험에 이용할때는 급속해동(전 항 참조)을 사용한다
사상균사의 동결보존은 1.2㎖ 용량의 동결 보존용 앰플(외경 12㎜)에 10%(v/v) glycerine을 0.8㎖ 분주한 후 면전하여 고압혐기멸균한다. 한천평판상에 배양된 사상균 콜로니에서 코르크 보러를 이용하여 균체 mat를 약 10 ㎜크기로 분리한 후 4개씩 상기의 앰플에 넣고 용봉한다. 균의 복원에는 급속해동을 한다. 이렇게 하여 보존능이 낮으면 분산매를 10% DMSO로 한다. 일반적으로 단 시간의 동결보존 후 균의 생잔이 양호하면 이후 장기보존에서도 양호한 생존을 기대할 수 있다.

⑤ 보존용기
보존용기는 알루미늄 또는 stainless steel로 만들어진 이중구조로 2중 벽 사이는 진공상태로 한다. 이 용기내에 액체질소를 넣어 보존용기로 한다.

⑥보존상의 주의
앰플의 밀봉이 불완전하면, 보존 중에 액체질소가 앰플 내에 들어가, 사용 시 밖으로 꺼낼 때 외부온도에 의해 액체질소가 급격히 기화 팽창하여 앰플이 폭발하는 위험이 있다. 밀봉 후 앰플을 4℃의 색소액에 담가두어 밀봉상태의 완전여부를 확인한다. screw cap 바이알의 사용은 위험하며 보존용기에서 앰플을 꺼낼 때는 플라스틱 안면 방호모를 사용하여 안전을 기한다.