[기본 필독코스2단계]미생물공학"미생물의 배양"

[colony]

제 4 장 미생물의 배양

■회분식배양

 1) 정의

    ① 반응물질(영양분, 균체, 기체)이 자가촉매 반응을 일으키는 폐쇄계

      폐쇄계: 산소를 제외한 모든 중요 부분이 시작부터 끝날 때까지 배출될 수 가 없다.

      예) 회분식, 유가식 배양

      개방계: 입출입이 가능하다. 예) 연속식, 반복 유가식 배양

    ② 산소 이용

      통기량: 0.5-1.5 vvm(air volume/working volume/min)

 2) 성장식

  (1) 대수식

    ① 미생물학적 접근 (그림)

      이분법

      X/X_O = 2ⁿ = 2 ^t/td       X = X_O 2 ^t/td                                   (1-1)

      ln(X/X_O) = n ln2 = t/t_d ln 2 = 0.693 t/t_d

      lnX= lnX_O + 0.693 t/t_d                                           (1-2)

    ② 화학공학적 접근 (그림)

      대수기의 성장(균형성장)은 1차 자가촉매화학 반응: 특정시간에서 세포의 증가 속도는 그 시간의 세포 수에 비례

                 ln(X/X_O) = μt                 (1-3)

      X = X_O exp(μt)                                                 (1-4)

    ③ 두 식의 연결: 2배 증가시간(t_d)

      (1-3)에서 ln2 = μt_d = 0.693                                    (1-5)

      (1-2)을 다시 나타내면    lnX= lnX_O + 1.443 t/t_d = lnX_O + μt             

    ④ 만약 대장균이 20분마다 분열하여 48시간 대수 증식을 한다면

      X_O = 10^-12 g,  

      t_d = 20 min (1-5)에서 μ = 0.693/(1/3) = 2.08 h^-1

      X = X_O exp(μt)에서 X = 10^-12 exp(2.08×48) = 2.2 × 10³¹ (지구무게의 4000배)

   (2) Monod 식

                                                            (1-6)

                                                          (1-7)

                                    (1-8)

      (1) (2) (3)에 의하여 변수 S를 제거하면

                                (1-9)

                                  (1-10)

                                  (1-11)

                  

                    

             Xo << So Y_X/S

      X_f ≒    So Y_X/S

      최종세포농도와 초기기질농도의 관계: 어느값까지 비례하지만 그 이상에서는 비례하지       않는다.

      비례구역: Bioassay, 기질의 결핍

      일정, 감소구역: 다른 기질의 결핍, 저해물질의 축척, 기질의 저해

  (3) 생산성

      총 회분 공정시간

      t_b = t_T + t_D + t_L + t_E

      t_T: turnaround time, 생산물질 회수 시간

      t_D: delay time, 다음 단계의 배양준비에 걸리는 시간

      t_L: lag time

      t_E: exponential growth time 1/μ_m ln(X_f/X_o)

                     (1-12)

      생산성 증가: 접종량 증가, t_T + t_D의 시간 단축, 활성이 좋은 종균 사용,

      비례관계 내에서 초기 기질농도 증가, 수율이 좋은 균주 개발

   (4) 속도식

      ① 기질 소비속도 dS/dt   산물생성속도 dP/dt

      ② 비 기질 소비속도 1/X dS/dt =q_S       비 산물 생성속도 1/X dP/dt = q_P

      ③ 수율 Y_X/S = △X/△S ≒ dX/dS        Y_P/S = △P/△S ≒ dP/dS

   (5) 유지 에너지

      총 기질 소비속도 = 성장에 대한 기질 소비속도 + 유지에 필요한 기질 소비속도

                       

                                                    (1-13)

      qs vs μ 절편=m, 기울기= 1/Y_X/S^*,  1/Y_X/S vs 1/μ 절편= 1/Y_X/S^*, 기울기=m

  (6) 생산물

    ① 산물생성식

                     q_P = αμ+β                      (1-14)

    ② 유도

      대사결과 기질에서 세포가 생기고 생성된 세포가 일정비율 생성물 생산

      1. 기질에서 세포 생성

      

        

       2. 생성된 세포가 일정비율 생성물 생산

        

                          (1-15)

     ③ 분류

      1. 미생물 성장과 연결된 산물(growth-associated product): 1차 대사 산물

        β=0 (그림: q_P, μ vs t 일정; q_P vsμ 비례)

        dP/dt =αdX/dt 또는 q_P = αμ

      2. 미생물 성장과 무관한 산물(non growth-associated product): 2차 대사 산물

        β=0 (그림: q_P, μ vs t 차이; q_P vsμ 일정)

        dP/dt = βX 또는 q_P = β

      3. 미생물 성장과 부분적으로 관련있는 산물(partial growth-associated product): 대부분의 산물

       α≠ 0 β≠ 0 (그림: q_P, μ vs t 겹침; q_P vsμ 기울기α 절편β)

                     q_P = αμ+β                   

 3) 성장곡선 (그림)

  (1) 유도기

    ① 정의

      미생물이 다른 환경에 옮겨졌을 때 적응하는데 걸리는 시간, 비 성장 속도가 최대치로 증가할 때까지 시간; ln(X/Xo)= μ(t-L)

      L: 대수기 접선과 초기 농도의 일치점 (시간)

    ② 원인

      1. 영양성분의 변화(저영양 -> 고영양)

      2. 물리적 환경의 변화

      3. 저해제의 존재

      4. 포자의 발아

      5. 접종균의 상태: 적거나 생존율이 적거나 오래되었을 때   예) 10⁵/ml -> 10⁷/ml

      6. 세포막에 의한 확산과정 중 균체 내부의 성분이 희석됨

    ③ 특징

      1. 균이 환경에 적응

      2. 효소단백질이 합성

      3. RNA 증가 DNA 일정

      4. 세포 질량은 증가하나 세포 수는 일정

  (2) 대수기

    ① 정의

      비 성장속도가 일정한 기간;  dX/dt = μ_m X

      균이 대수적으로 증가, 세대기간이 일정, 세포질의 합성속도와 세포수의 증가가 비례

    ② 조건

      1. 모든 영양분이 충분(미세 성분 포함)

      2. 완전한 혼합

      3. 모든 세포가 성장 능력을 지님

      4. 저해제가 없음

    ③ 특징

      1. 무제한 성장(unlimited growth): 모든 성장 조건(물리적, 화학적, 생물학적)이

         최적    세포의 생리적 활성이 가장 강한 시기

      2. 균형성장(balanced growth): 거대분자의 조성이 일정,

      3. 물리적, 화학적 처리에 대한 감수성이 높은 시기

  (3) 정상기

    ① 정의

      대수기 이후 비 성장 속도가 감소하는 시기 또는 비 성장 속도가 zero인 시기

    ② 원인

      1. 영양분의 이용성 감소 및 영양분의 고갈,

      2. 새로운 딸세포의 성장 능력 감소

      3. 대사 생성물이 저해제 역할 또는 독성물질의 축척,

      4. 물리적 스트레스

      5. pH의 변화, 산소 부족

      6. 포자의 형성

    ③ 특징

      1. 세포수는 최대, 생균수는 일정

      2. 대수기와는 다른 화학적 조성

      3. 포자를 형성하는 시기

      4. 성장하는 세포수와 사멸하는 세포수가 동일한 시기

      5. 비균형성장

  (4) 사멸기

    ① 정의

      비 성장 속도가 zero보다 작은 시기

    ② 특징

      1. 생균수 감소

      2. 세포의 사멸

      3. 효소 작용에 의한 자기 소화 (용균)

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■연속식배양

 1) 정의

    ① 영양분 첨가와 같은 양의 제거로 균체가 포함되어 있는 상태로 오랜기간 성장을

       유지하는 개방 성장계

    ② 정상상태(steady state): 균체농도, 비 성장속도, 배양환경(기질 및 생성물의 농도)

       이 시간에 따른 변화없음

      chemostat: 유속 일정             turbidostat: 균체농도 일정

    ③ 적용: 미생물이 환경에 대한 반응조사, 최적조건하에서 균체, 산물의 연속생산

    ④ 구성장치: 배지 첨가용 용기(첨가속도 조절, 무균 reservoir),

       일정부피의 배양조(pH, 온도, 통기량, 교반속도)

 2) 종류

  (1) Chemostat (constant chemical)

    ① 일정부피 유지: 배지를 일정속도로 공급, 같은 속도로 방출(D 고정, X 변화)

    ② 하나의 영양분(균체농도 조절 인자)을 제외한 모든 성분 과량 존재

    ③ 성장속도를 고정하고 환경을 변화시켜 생리적 특성 조사

  (2) Turbidostat (constant turbidity)

    ① 배양액의 탁도를 측정하여 유속을 변화시켜 균체농도를 일정하게 유지.

       부피를 overflow device로 유지

    ② 세포농도가 일정하게 유지되므로 특정환경(예, 고농도 에탄올)에서 저항 균주 선별

    ③ 적당한 균체 농도를 측정하는 기구 필요

      1. 탁도 측정: spectrophotometer, laser turbidometer

      2. 이산화탄소 압력 일정 유지

      3. 산 생산시 pH 전극으로 조절

      4. 기질농도로 조절 예) glucose analyser

      5. 용존산소 측정으로 조절

      6. 기체상에서 산소 또는 메탄같은 기질 소비로 측정

   (3) Plug-flow 연속배양기 (back mixing이 없는 일정 유속)

    ① 성장이 회분식 배양과 유사: 거리가 배양시간을 대신함

    ②문제점: biomass의 부착, plug flow(back mixing이 존재), aeration을 유지하는 것이 어렵다.

    ③폐수처리, 혐기발효(요구르트, 치즈), 장의 균서식 모사에 사용

  3) 수식

   (1) 세포의 물질 수지

      세포 in  － 세포 out ＋ 세포성장 ＝ 세포축척

      F/V X_O － F/V X  ＋ μX      ＝  dX/dt                              

      1. X_O = 0       2. F/V = D    3. dX/dt ＝  0

      －DX + μX = 0

      μ= D (생리적 인자 = 물리적 인자)                               (2-1)

   (2) 영양성분의 물질 수지

      영양분 in－영양분 out－영양분 소비(성장)＋영양분 소비(유지) ＝ 영양분 축척

      F/V S_O － F/V S   －  μX/Y_X/S     －      mX         = dS/dt

      1. F/V = D     2.  m ≒ 0

      3. dS/dt = 0

      D (S_O － S) = μX/Y_X/S = DX/Y_X/S

      X = Y_X/S (S_O － S)                                              (2-2)

   (3) 성장 수식

                   

      DK_S ＋ DS = D_CS

                                                         (2-3)

      (2-2)에서                              (2-4)

      P = dX/dt = μX = DX

                                           (2-5)

   (4) 산물

      산물 in  － 산물 out ＋ 산물 생성 ＝ 산물축척

      F/V P_O － F/V P  ＋ q_PX      ＝  dP/dt      

      1. X_O = 0       2. F/V = D    3. dX/dt ＝  0

      －DP ＋ q_PX = 0        P = q_PX/D                              (2-6)

    ① growth associated product

      q_P = αμ＋β    β= 0          q_P = αD

      (2-6)에서         P = αDX/D =αX

    ② non-growth associated product

      q_P = αμ＋β    α= 0          q_P = β

      (2-6)에서         P = βX/D

    ③ partially growth associated product

      q_P = αμ＋β    

      (2-6)에서         P = αX ＋βX/D

 (5) 생산성

    ① 회분식 생산성

      (1-12)에서

      

    ② 연속식 생산성

      dP/dD = 0에서

                                            (2-7)

      (2-4)에서

      

      

      

      P = D_MX_M = D_CY_X/SS_O = μ_maxY_X/SS_O

    ③ P(연속식)/P(회분식)

                                             (2-8)

      접종량이 최대 균체량의 5% 이면 X_f/X_o = 20, t_T＋t_D＋t_L = 10시간이라면

 4) 실제 Chemostat

  (1) Monod 식이 잘 안 맞음 (주로 낮은 성장속도)

    ① 탄소원 제한 Chemostat

      탄소원을 제한하는 경우 성장속도와 상관없이 유지(maintenance)에 들어가는 탄소

      에너지 량은 일정 -> 성장속도가 낮을수록 총 탄소에너지 중 유지에 들어가는

      탄소에너지 량의 비율이 높아짐 -> 세포농도 감소

      영양분 in－영양분 out－영양분 소비(성장)＋영양분 소비(유지) ＝ 영양분 축척

      F/V S_O － F/V S   －  μX/Y_X/S     －      mX         = dS/dt

      1. F/V = D     2.  dS/dt = 0

      D (S_O － S) = μX/Y_X/S ＋ mX= (D/Y_X/S ＋ m)X

                                    (2-9)

    ② N-, S- 제한 Chemostat

      낮은 성장속도에서 저장물질(지방, 다당류, PHB) 축척 -> 낮은 성장속도에서 세포농도

      증가

      세포농도를 cell protein g/L 또는 N g/L로 표시하면 이론곡선과 동일

    ③ P-, Mg-, K- 제한 Chemostat

      낮은 성장속도에서 P-, Mg-, K- 제한 배지(RNA와 관련)에서 RNA를 적게 요구 -> 낮은

      성장속도에서 P-, Mg-, K-가 세포수 증가하기에 충분

    ④ 복합배지에서의 Chemostat

      성장속도가 빨라질수록 제한되는 영양분이 많아짐 -> 성장속도가 빨라질수록 세포농도

      가 서서히 감소

  (2) 부적합한 기구 (주로 높은 성장속도)

    ① Foam에 의한 불완전한 혼합 (D는 실험식)

      dX/dt = μX- DX_F = 0          D = μX/X_F

      X_F>X   X/X_F < 1              D_{C exp} < D_{C thr}

    ② 세포침강 (sampling tube에서)

      dX/dt = μX- DX_S = 0          D = μX/X_S

      X_S<X   X/X_S > 1              D_{C exp} > D_{C thr}

   ③ 기벽성장(wall growth)

      dX/dt = μX ＋ μ_wX_w- DX = 0 DX = μX ＋ μ_wX_w

      D = μ ＋ μ_wX_w/X              D_{C exp} > D_{C thr}

   ④ 물질전달 제한 (불완전혼합과 유사)

      이용할 수 있는 배지가 적어짐

      dX/dt = μX- DX_M = 0         D = μX/X_M

      X_M>X   X/X_M < 1             D_{C exp} < D_{C thr}

      예) C₁₆가 0.5% 일 때, D_C가 0.25 h^-1; C₁₆가 1.0% 일 때, D_C가 0.16 h^-1

 5) Chemostat의 변형

  (1) 세포 재사용 연속배양

      세포 재사용; 연속적인 접종, 무균적으로 연속원심분리는 큰 규모에서 가능

    ① 특징

      1. system의 안정성 증가

      2. 공정 중 변화 최소화

      3. 고농도에서 정상상태 유지

      4. 생산성의 증가; 희석율이 최대 비 성장속도보다 높다.

    ② 세포수지

      α: 재사용율, C: 농축율           F      (1＋α)F, X₁

                               αF  Reactor  연속원심분리기   F₁, X₂

                                      CX₁ (농축세포)

      첨가배지 중 세포 ＋ 재사용 세포 － 세포 out ＋ 세포성장 = 세포축척

          F/V X_O  ＋ αF CX₁/V － (1＋α)F X₁/V ＋ μX₁  =  dX₁/dt

      αD CX₁ － (1＋α)D X₁ ＋ μX₁  = 0                 

       μ= (1＋α)D - αDC = (1＋α－αC)D                           (2-10)

      C > 1, 1＋α-αC < 1  μ<D

    ③ 기질수지

      첨가배지 중 기질 ＋ 재사용 기질 － 기질 out － 기질소비 = 기질축척

          F/V S_O  ＋ αF S/V － (1＋α)F S/V － μX₁/Y_X/S  =  dS/dt

      DS_O ＋αDS － (1＋α)DS = μX₁/Y_X/S                

      X₁ = Y_X/SD(S_O－S)/μ                                            (2-11)

      (2-10)에서

      X₁ = Y_X/SD(S_O－S)/(1＋α－αC)D = Y_X/S(S_O －S)/(1＋α- αC)

      Monod 식에서

                             (2-12)

                  (2-13)

    ④ 예) μ_max = 1 h^-1, μ = 0.8 h^-1, Y_X/S = 0.5, K_S = 1 g/L, S_O = 10 g/L, C = 2,

           α = 0.5

      1. No recyle

        

        X = Y_X/S(S_O－S) = 0.5 × (10 -1) = 4.5 g/L, D_C = 1 h^-1

      2. Recyle

        X₁ = Y_X/S(S_O－S)/(1＋α－αC) = 0.5 × (10 -1)(1＋ 0.5 － 0.5 ×2) = 9 g/L

      (2-10)에 의해서  D_C = μ_max / (1＋α－αC)= 1/(1＋ 0.5 － 0.5 ×2) = 2 h^-1

        (1＋α)X₁ = αCX₁ ＋ X₂,

        X₂= (1＋α)X₁－αCX₁ = (1＋ 0.5)×9 － 0.5 × 2 × 9 = 4.5 g/L

  (2) 2단계 연속배양

      F, S_O            X₁, S₁   (F', S_O')      F₍₂₎, S₂, X₂

    ① 1단계

      μ₁= D₁, X₁ = Y_X/S (S_O － S)

    ② 2단계 세포수지

      1단계 세포 in  － 2단계 세포 out ＋ 2단계 세포성장 ＝ 2단계세포축척

      F/V₂ X₁ － F/V₂ X₂  ＋ μ₂X₂ ＝  dX₂/dt                        

      D₂ X₁ － D₂ X₂  ＋ μ₂X₂ ＝  0                          

      μ₂ ＝ D₂ (1 － X₁/X₂ )                                          (2-14)

      X₁/X₂ < 1,  μ₂ < D₂

    ③ 2단계 기질수지

      1단계 영양분 in －2단계 영양분 out － 2단계 영양분 소비＝ 2단계영양분 축척

      F/V₂ S₁ － F/V₂ S₂   －  μ₂X₂/Y_X/S    = dS₂/dt

      D₂ (S₁ － S₂) = μ₂X₂/Y_X/S

      X₂ = Y_X/S D₂(S₁ － S₂)/μ₂                                       (2-15)

      (2-14)와 (2-15)에서

      Y_X/S = μ₂X₂/D₂(S₁ － S₂) = D₂ (1 － X₁/X₂ )X₂/D₂(S₁ － S₂)

           = (X₂ － X₁)/(S₁ － S₂)                                     (2-16)

   (3) 다단계 연속배양

    ① n단계 세포수지

      n-1단계 세포 in  － n단계 세포 out ＋ n단계 세포성장 ＝  n단계 세포축척

      F/V_n X_n-1 － F/V_n X_n  ＋ μ_nX_n ＝  dX_n/dt                              

      D_n X_n-1 － D_n X_n  ＋ μ_nX_n ＝  0                        

      μ_n ＝ D_n (1 － X_n-1/X_n )                                        (2-17)

      X_n-1/X_n < 1,  μ_n < D_n

      D_n (X_n －  X_n-1)  = μ_nX_n = (dX_n/dt)_Growth

      if D₁ = D₂ = .... = D_n

      X_n －  X_n-1 = (dX_n/dt)_Growth/D                                    (2-18)

      dX/dt  vs X, slope = D  (반원 모양)

      X₁은 X₀에서 시작하여 기울기 D와 dX/dt가 만난점의 x절편,

      X₂은 X₁에서 시작하여 기울기 D와 dX/dt가 만난점의 x절편

      회분식 배양 dX/dt = DX

      dX₁/dt - 0 = D (X₁ - X₀), dX₁/dt는 X₁의 y절편

    ② n단계 기질수지

      n-1단계 영양분 in －n단계 영양분 out － n단계 영양분 소비＝ n단계 영양분 축척

      F/V_n S_n1 － F/V_n S_n   －  μ_nX_n/Y_X/S  = dS_n/dt

      D_n (S_n-1 － S_n) = μ_nX_n/Y_X/S

      X_n = Y_X/S D_n(S_n-1 － S_n)/μ_n                                      (2-19)

      (2-17)와 (2-19)에서

      Y_X/S = μ_nX_n/D_n(S_n-1 － S_n) = D_n (X_n －  X_n-1)/D_n(S_n-1 － S_n)

           = (X_n －  X_n-1)/(S_n-1 － S_n)                                 (2-20)

  (4) 다단계 연속배양의 목적

    ① 모든 기질의 이용

      glucose(1단계)와 maltose(2단계)의 혼합물

    ② 성장 저해제가 있거나 1단계 chemostat에서 steady state를 얻기 어려운 경우

      steady state growth를 얻기 위하여 사용

    ③ 2차 대사산물의 생산

      1단계: growth stage (높은 D, 성장 최적조건)

      2단계: production stage (낮은 D, 생산 최적조건)

    ④ 재조합 미생물의 배양(단단 chemostat는 사용불가)

      1단계: 유도물질 첨가하지 않음 -> plasmid가 없는 세포가 성장의 장점이 없다

      (높은 D, 성장 최적조건)

      2단계: 유도물질 첨가 -> 산물은 많이 생산하나 성장속도가 많이 감소, plasmid가

      없는 세포가 성장에는 유리

      (낮은 D, 생산 최적조건)

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■유가식배양

 1) 정의

     : 회분식 배양에서 연속적으로 배지를 첨가하고 배양이 끝날 때까지 배양액을 빼내지 않는 반연속식 또는 가변체적식 연속배양

    ■ 반복 유가식배양 (Repeated fed-bach culture): 배양액의 일부를 반복적으로 제거하는 배양

 2) 이용

    ① 고농도 균체를 얻음

    ② 기질저해 극복: ethanol, methanol 등

    ③ Catabolite repression 극복: 기질이용속도를 제한: 포도당

    ④ Glucose effect 제거

    ⑤ 배양시간의 확대: 항생제

    ⑥ 수분 증발의 보충

    ⑦ 배양액의 점도감소

    ⑧ Auxotroph의 배양

    ⑨ 균체수율의 증가: hydrocarbon

 3) 분류

  (1) Feedback 제어가 없는 경우

    ① 일정 공급: F=일정, S=변화

      기질이 제한됨, 생성산물 최대화

    ② 지수적 공급: F=지수증가, S=일정

      기질이 제한 안됨, 균체농도 최대화

    ③ 간헐 공급: 편리

  (2) Feedback 제어가 있는 경우:

      수학적 표현이 필요없다.

    ① 직접제어: methanol-stat(GC연결)

      배양액안의 배지의 성분을 분석

    ② 간접제어: 대사반응에 따른 변동인자(pH, DO, OUR, Q_CO2, RQ)의 조절.

       a. 일정값 제어, b. 최적제어

 4) 일정 유속 유가식 배양법

      x=[g/l],  s=[g/l], p=[g/l], D=F/V=[1/h]

      X=[g],   S=[g],  P=[g],  V=[l]   

      F=[l/h]=일정

        

      세포농도가 최대치에 도달하면 기질은 거의 고갈

                                    (3-1)

                               (3-2)

   (1) 세포농도

      

                 (3-3)

      ■ 준정상 상태(Quasi-steady state):

      시간에 따라 세포농도 x[g/l]가 일정

                                                     (3-4)

      연속배양: 시간에 상관없이 ,  유가배양: 시간이 증가 -> 감소, 감소

  (2) 기질농도

      기질 in - 기질 out = 기질축척

        

                                                       (3-5)

     ■ 준정상 상태(Quasi-steady state): 시간에 따라 기질농도 s[g/l]가 일정

        그러므로, (5)식은 다음과 같다

                                                  (3-6)

                      (3-7)

                                                 (3-8)

  (3) 생성물농도 (q_p=일정할 때, x=x_m)

       

    (3-2)에 의하여         

                                         (3-9)

 5) 지수 유가식 배양법

                     

                              (3-10)

  (1) 세포농도

      

                                         (3-11)

  (2) 기질 농도

      (3-6)에 의하여        ,                 

      (3-10)에 의하여                         (3-12)

   3) 생성물농도  (q_p=일정할 때, x=x_m)

       

      (3-10)에 의하여  

      

                                (3-13)

 6) 일정 유속 반복  유가식 배양법

  (1) q_p가 일정할 때

      t_c: 반복시간(cycle time)

      V_c: 제거되기 직전의 배양액의 부피

      γ: 최소부피/최대부피        

      

                                          (3-14)

                              (3-15)

      (3-15)를 (3-14)에 대입   

                                            (3-16)

  (2) q_p가 일정하기 않을 때

      (3-14)에서 q_p가 일정하기 않으면 다음과 같다.

        

      if q_p = 일정,  

      

      

                            

      

                                         (3-17)

                             

               연속 배양에서는 ,

      반복 유가식 배양에서 생산물 농도는 연속배양의 생산물 농도를 초과할 수 없다.

      그러나, 준 정상 상태에서는 정상상태와 효소의 조성이 달라 생산물 형성을 촉진하는

      경우도 있다.

   예) V= 1000 mL, F = 200 mL/h, S_O= 100 g/L, X_O= 30 g, μ_max=0.3 h^-1, K_S= 1 g/L

      Y_X/S= 0.5 g/g, P_O=0 g/L

      1. V_O    2. 준정상 상태에서의 S(g/L)     3. t = 2 h에서 X (g)

      4. q_P = 0.2 g/g-h, t = 2 h에서 P (g/L)

   답) 1. V = V_O ＋ Ft         V_O= 1000 － 200 × 2 = 600 mL

      2. D = F/V = 200/1000 = 0.2 h^-1,

         S = DK_S/(μ_max-D) = 0.2 × 1 /(0.3-0.2) = 2 g/L

      3. X= X_O ＋ FY_X/St = 30 ＋ 0.2 × 0.5 × 100 × 2 = 50 g

      4.

         P = 0 ＋ 0.2 × 50 × (0.6 ＋ 0.2 × 2 / 2) × 2 = 16 g/L

                  P _n = 16/(1－0.6) = 40 g/L

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