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1 균주 개발 방법
①
자연계로부터 분리한 균주: 유용물질의 축척량이 적다.
② 생산성 향상 방법: 배양조건
최적화--- 한계
보다
좋은방법--- 유전자의 개량
③ 유전 형질의
개선: 자연 변이주 선별, 돌연변이주 선별, 유전자 조작,
세포융합
자연 변이주
선별: 확율이 낮다. 분포가 좁다.
돌연변이주
선별(mutagen을 사용; UV, NTG): 확율이 높다. 분포가 넓다.
2. 돌연변이주 선별방법
1)
Directed mutation(변이제 및 변이방법의 선택):
목적에 적합한 특수 변이주를
높은 비율로 만들어 내는 방법
① NTG:
세균--- 복제점 주위의 특정 부위 변이-> 세균의 변이점
파악
(*진핵세포---
복제점 주위의 많은 부위 변이->변이점 파악이 어려움)
② 유전자 cloning: 특정 위치가 변이된 돌연변이주와
같다.
Cloning된
maker의 유무로 확인 가능
(유전자의
구조가 확실하게 되어 있지 않은 균에서도 사용 가능)
2) 희망 변이주의 분리 정도 향상
①
선택적 maker 사용
② 대사 조절 기구
파악
1. 정의
① 미생물
생존에 필요한 기본 구성 성분
1.
최종산물: 세포 구성물질의 전구체로 사용
ex)
아미노산, purine 및 pyrimidine nucleotide
2.
중간체: 주 대사 경로의 중간 생성물
ex)
citric acid, glycolysis, pentose phosphate pathway
② 대량 생산: 균주선별(영양요구성 균주),
유전자 변이(주로 feedback regulation),
막투과성
개선, 환경조건 최적화
2. 막투과성 개선
①
Biotin 제한: 막투과성 개선, 막 생합성시 인지질 부족
* biotin의 역할: 지방산 합성 효소
acetyl-CoA carboxylase의 조효소
Acetyl
CoA + CO2 → Malonyl CoA →(불포화) 지방산 합성
(Palmitic
acid C16, Oleic acid C18 합성) → 세포막; 1차 대사산물
투과성 저하
② 세포막 내의 oleic acid
제한: biotin과 동일한 역할
③ Biotin을
제한하지 못할 때: 막 투과성 개선제 첨가
1.
Penicillin, Cepharosporin C: 세포벽의 기본구조인 peptidoglycan의
peptide의
교차결합
형성을 저해
2. 계면활성제(C16,
C18 포화지방산과 다가 alcohol의 ester 결합): 계면 효과에
의한
투과성
증가 예) Tween 80
④ 막투과성이 좋은
변이주 선별: glycerol 요구성 변이주(인지질 합성능이
glycerol 첨가
량에
의존)--- 소량의 glycerol 첨가, 인지질 합성능 저하
3. Feedback regulation의 해제(그림
3-27)
① 단순 경로
enz a enz b enz
c
A
→ B → C
- - - D → E (제한
농도 첨가)
1.
영양 요구성 변이주 (auxotropic mutant; E를 요구)를 얻는다.:
효소 c가 부족
2.
제한 농도의 E를 공급
3.
Feedback regulation의 해제: C를 과잉생산
②
concerted (합동) feedback regulation의 해제: 분지 경로중
하나의 영양요구성 균주를
얻는다.
F
G
A
B C --- D E
(제한농도 첨가) "C" 축척
③
isoezyme(동위 효소)와 cumulative(백분율) feedback regulation의
해제: 분지 경로
중
두개의 영양요구성 균주(double auxotroph)를 얻는다.
---
F G (제한농도 첨가)
A
B C ---
D E (제한농도 첨가) "C"
축척
* sequential feedback
regulation의 해제는 영양요구성 균주로는 안 된다.
④ concerted (합동) feedback regulation의
해제(최종 산물의 축척): 분지 경로중
최종산물과
관련 없는 하나의 영양요구성 균주를 얻는다.
--- F
G (제한농도 첨가)
A
B C D
E "E" 축척, E 분해
효소의 제거
* 다른 feedback
regulation의 해제는 영양요구성 균주로는 어렵다.: isoezyme(동위
효소)는
효과없고 cumulative는 약간 효과 있다.
⑤
Corynebacterium glutamicum의 lysine 생산(그림 3-29)
1. 최초의
효소인 aspartokinase는 lysine과 threonine의 concerted
feedback
inhibition을
받음
2.
homserine dehydrogenase는 threonine에 의해 feedback
inhibition, methionine
에
의해 feedback repression을 받음
3.
homeserine auxothroph를 구함: homeserine 또는 threonine과methionine을
요구
4.
aspartokinase는 lysine과 threonine의 concerted feedback
inhibition 해제 및
aspartate
semialdehyde는 lysine 쪽으로 만 대사 진행
⑥
Bacillus subtilus의 IMP 생산(그림 3-31, 3-32, 3-33)
1. PRPP
amidinotransferase는 AMP에 의해서 feedback inhibition을
받으며 GMP에
의해서도
경미한 feedback inhibition을 받는다.
2.
PRPP amidinotransferase는 AMP와 GMP에 의한 concerted
feedback inhibition을
받는다.
3. IMP
dehydrogenase는 GMP에 의해서 feedback inhibition과 repression을
받는다.
4.
Adenylosuccinate synthase는 AMP에 의해서 feedback inhibition을
받는데 강하
지
않다.
5.
AMP 요구주나 AMP와 GMP 이중 요구주 선별
4. Feedback regulation 저항
변이주
단순 경로에서 최종산물을
과잉생산 하고자 하면 영양요구성 균주로는 얻을 수 없다.
1) Analogue 내성 균주
① Analogue(유사
물질): 화합물의 구조가 매우 유사한 화합물의 총칭, 아미노산과
핵산의
analogue는
유독
*독성인 이유
1. 구성성분으로
들어간 결과 결함이 있는 생체성분 만듬
2.
생합성에 사용되지 않고 최종산물과 유사하여 최종산물에
의한 제어기구와 같은
형태로
생합성을 교란; E의 analogue E'는 계의 최초의 효소를
feedback 제어를
하지만
없어지지 않아 E의 생합성이 저해되며 그 결과 세포는 증식할
수 없다.
② Analogue 내성 균주:
1. feedback
regulation에 저항(최종산물 과잉생산)
2.
analogue 분해 효소 존재(최종산물 정상생산); 1번을 찾음.
- feedback inhibition 저항 균주: 대사 경로의
첫 효소가 allosteric enzyme으로 기질이
결합하는
반응관여 sub-unit는 변화가 없고 최종산물이 결합하는
sub-unit가 변화되
어 최종산물이
결합하지 못한다.
- feedback repression
저항 균주: 항상 transcription (A→B) = constitutive
mutant
(구성돌연변이주)
i) apo-repressor인
allosteric protein으로 operator에 결합하는 sub-unit는
변화
가
있어 repressor가 DNA 상에 결합하지 못하거나(R-)--- inactive
repressor
ii)
최종산물(co-repressor)이 결합하는 sub-unit는 변화되어
최종산물이 결합하지
못하여
repressor가 DNA 상에 결합하지 못하거나(R-)--- inactive
repressor
iii)
operator가 돌연변이가 일어나 repressor가 붙지 못함(Oc)
③ Analogue 내성 균주 분리법
Analogue 포함 배지 Analogue
불포함 배지
Analogue 농도 농후
희박
생육되지 않는 지역 생육되는
지역
(내성주)
1. Analogue
포함 배지와 포함하지 않은 배지에서 각각 plating 확인
2. Feedback
regulation에 저항인가 analogue 분해 효소 존재인가 확인
④ Brevibacterium flavum의 lysine analogue
내성주
1.
최초의 효소인 aspartokinase는 lysine과 threonine의 concerted
feedback
inhibition을
받음
2.
lysine analogue인 S-(2-aminoethyl) cysteine (AEC)은
threonine 존재하에
Brevibacterium
flavum의 생육을 완전 저해. Threonine 없이는 일부만 억제.
3.
AEC 내성주와 threonine auxothroph를 구함: aspartokinase에
대한 lysine과
threonine의
concerted feedback inhibition의 감도가 낮아짐.
2) 복귀변이주 (revertants)
① 생성기작
enz a enz b enz
c
A
→ B → C
→ D → E
enz
a: feedback sensitive enzyme
정상세포
(돌연변이) → 돌연변이주 (영양요구성 균주; enz a를 생산할
수 없음)
(돌연변이)
→ 복귀변이주 (변형된 enz a를 생산)
②
복귀변이주; 단백질의 변화
- feedback
inhibition 저항 균주: 대사 경로의 첫 효소가 allosteric
enzyme가 아니다.
기질이
결합하는 반응관여 sub-unit는 변화가 없고 최종산물이
결합하는 sub-unit가 변
화되어
최종산물이 결합하지 못한다.
- feedback
repression 저항 균주; 항상 transcription (A→B) = constitutive
mutant
(구성돌연변이주):
apo-repressor가 allosteric protein가 아니다. operator에
결합하는
sub-unit는
변화가 있거나 최종산물(co-repressor)이 결합하는 sub-unit는
변화되어 최
종산물이
결합하지 못하여 repressor가 DNA 상에 결합하지 못한다.
③ Brevibacterium flavum의 복귀변이주에
의한 lysine 생산
homserine
dehydrogenase 결손주의 복귀변이주: homserine dehydrogenase의
활성이
낮아
threonine과 methionine이 미량 생산되어 concerted
feedback inhibition이 해제
④ 영양요구성와
analogue 내성주 양쪽 부여시 생산성 향상이 뛰어남.
예)
Bacillus subtillus의 GMP 생산
1.
AMP 요구성: PRPP amidinotransferase의 concerted feedback
inhibition의 해제
2.
GMP analogue(8-azaguanine) 내성: IMP dehydrogenase의
feedback inhibition과
repression의
해제
5. Induction 저항 변이주; constitutive
mutant
① 유도물질을 제한기질로 한 연속배양(chemostat)에서
성장하는 균을 분리하여 얻음.:
연속배양에서
기질의 농도는 낮은 편이며 효소 유도 한계농도보다 낮으면
유도효소를
만드는
균주보다 구성변이주가 많아진다.→ 분리
②
유도물질이 포함된 배지와 포함되지 않은 배지 사이로 균체를
순환: 유도 효소를 만드
는
균은 유도기가 필요, 구성변이주는 유도기가 불필요
③ 효소 유도능이 낮은 유도물질을 배지로
사용하면 구성돌연변이주를 농축할 수 있다.
예)
phenyl-β-galactoside를 사용하여 β-galactosidase 구성돌연변이주
분리
④ 구성변이주의 고체배지상 선별
방법: 유도물질로 작용하지 않는 발색물질 첨가:
변이처리된
균의 β-galactosidase 구성변이주에 ο-nitrophenyl-β-D-galactoside
첨가,
분해 → 발색(구성변이주), 분해× → 발색×
6. Catabolic repression
저항 변이주
① 복귀변이주 중에는 catabolic
represion이 해제된 변이주도 있다.
예)
β-galactosidase에 대한 catabolic repression 저항 변이주를
lactose 이용능
결손
변이주의 복귀변이주로부터 얻음.
② 질소원
분해 효소: 빨리 이용되는 기질을 고농도로 탄소원으로
사용하고 제한 농도의
(효소
얻을)질소원을 사용하여 연속배양(chemostat)을 하여 질소원의
catabolic
repression
저항 변이주를 얻음, 몇 가지 효소의 억제를 동시에 해제.
예) serine을 제한량 첨가하고
glucose를 과잉 첨가한 연속배양에서 serine deaminase
의
catabolic repression 저항 변이주를 얻음.
③
Catabolic repressor를 첨가한 chemostat에서 catabolic
repression 저항 변이주를
분리
1. 정의
①
성장단계에서 후반부에 합성되는 물질: 성장에는 요구되지
않으나 생존에 필요한 물질
*
생합성을 모르는 경우가 많지만 최근에 많이 알려짐
예) 곰팡이나 actinomyces에
의해 생산: antibiotics, mycotoxins, pigments,
alkaloid,
hormone
② 1차 대사에 의해 생산된 전구체에
의해 2차 대사물질이 생성
③ 성장기(trophophase)와
생성기(idiophase)로 구별됨:
-
prevent suicide: trophophase 초기에 대부분 미생물은
자신의 항생제에 민감하지만
idiophase에는
저항
- trophophase 말기에는 2차
대사산물에 관련된 효소가 생성
2. Induction의 이용
1차
대사산물(amino acid; 전구체 및 유도물질)에 의해서 2차
대사산물(antibiotics)의
생산에 관련된
효소가 유도되는 현상
① 1차 대사산물
analogue 첨가: 2차 대사산물의 전구체로 사용되지 않으나
2차 대사산물
생산을
증대시킨다.
② 1차 대사산물의 첨가:
trophophase에는 효과적 idiophase에는 효과 없다.
1. 1차 대사산물이 2차
대사산물의 관여 효소를 induction
2.
2차 대사산물에 가까운 중간 대사산물들이 inducer로서
더 약하다.
③ 첨가된 1차 대사산물은
2차 대사산물이 생성되기 직전에 배지에 없고 내부농도가
보통
보다 2∼3 배 증가되어
있다.
④ 1차 대사산물의 생성을 genetic
blocking을 시키면 2차 대사산물은 생성되지 않는다.
ex)
methionine---cephalosporin, tryptophan---alkaloid
3. Catabolite regulation의 이용
1) Carbon catabolite regulation
① 정의:
빨리 이용되는 탄소원을 첨가하였을 때, 2차 대사 산물의
catabolic pathway에
관련된
효소가 repression, inhibition
② 기작:
빨리 이용되는 탄소원은 c-AMP의 생성을 방해 → CAP이
DNA에 붙지 않음 → 2차
대사
산물의 생산에 관련된 효소가 생성 않됨
③
해결방법:
1. 느리게
이용되는 탄소원 사용
2.
느리게 이용되는 탄소원의 analogue 사용
3.
유가식 배양을 사용하여 탄소원의 공급속도를 느리게함
4. catabolite regulation에
저항하는 균주 사용
2) Nitrogen catabolite
regulation
① 정의: 빨리 이용되는
질소원을 첨가하였을 때, 2차 대사 산물의 catabolic pathway
에
관련된 효소가 repression, inhibition
②
기작: 빨리 이용되는 질소원은 c-AMP의 생성을 방해 →
CAP이 DNA에 붙지 않음 → 2차
대사
산물의 생산에 관련된 효소가 생성 안됨
③
해결방법:
1. 느리게
이용되는 질소원 사용
2.
느리게 이용되는 질소원의 analogue 사용
3.
유가식 배양을 사용하여 질소원의 공급속도를 느리게함
4. catabolite regulation에
저항하는 균주 사용
3) Phosphate catabolite
regulation
① 정의: phosphate를 첨가하였을
때 2차 대사 산물의 catabolic pathway에 관련된 효소가
repression,
inhibition
② 기작:
1.
phosphate는 1차 대사를 촉진: phosphate를 첨가하였을
때 phosphatase (2차 대사
산물의
생합성에 관련된 효소) repression or inhibition
2.
phosphate의 고갈은 1차 대사(trophophase)에서 2차 대사(idiophase)로
전환을 일으
킴:
idiophase에서 phosphate를 첨가하면 2차 대사산물의 생성이
중지됨.
3. 과량의
phosphate는 탄수화물 대사를 pentose phosphate pathway(12
NADPH2 생성)를
glycolytic
pathway(2 NADPH2 생성)로 전환: NADPH2의 부족 → 2차
대사산물 합성저해
4.
phosphate는 2차 대사산물의 induction을 제한: 과량의
phosphate에서는 2차 대사산
물
생합성의 첫 효소가 생성되지 않음
phosphate는
c-AMP의 생성을 방해, ATP 생성 촉진 → CAP이 DNA에 붙지
않음 → 2차 대
사
산물의 생산에 관련된 효소가 생성 않됨
③
해결방법: phosphate 농도를 제한해야함.
4. Feedback regulation의 이용
1) 영양요구성 변이주
① 2차 대사산물은
1차 대사산물로부터 뻗어나간 분기된 대사경로의 최종산물
② 2차 대사산물 생성과정 중 1차 대사산물이
branched pathway로 파생될 때: 1차 대사산
물의
영양요구성 변이주 선별 → 분지 경로의 차단, 1차 대사산물의
feedback
regulation의
해제에 의한 2차 대사산물 과잉생산
예)
Penicillum chrysogenum에 의한 pencillin 생성시 lysine
요구주(그림 3-40):
③ 2차 대사산물의
생합성과 연관 없는 1차 대사산물의 영양요구성 변이주에
의한 2차 대
사산물의
생산성 증가
1. 1차
대사산물의 영양요구 물질과 2차 대사산물 또는 그 전구물질과
교차경로의 조절
기구
형성: 1차 대사산물이 직접 연관 없는 2차 대사산물의 생합성
경로에 의해서 조절
받고
있다.
2. 영양요구성
변이가 일어남에 따라 다른 변이도 일어나는 이중 변이:
일부의 경우만 적용
2) Analogue 또는 대사물질 내성균
① 2차 대사산물의 1차 대사 전구물질의
analogue 내성균: feedback regulation의 해제에
의한
1차 대사산물의 과잉생산 → 2차 대사산물 과잉생산
예) Pseudomonas aureofaciens에
의한 항생제 pyrrolnitrin 생산:
tryptophan은
pyrrolnitrin의 전구체: tryptophan을 과잉 첨가하면 비경제이고
feedback
저해로 한계 존재 -> tryptophan analogue 내성균을
구하면 feedback 저해가
해제되고
tryptophan이 과량 생산되어 항생제 pyrrolnitrin 생산량이
증가한다.
② 2차 대사산물의 feedback
저해가 해제된 변이주:
1.
배지에 2차 대사산물 첨가 후 2차 대사산물 과잉 생산균
선별:
2차
대사산물의 analogue를 찾기 힘들때
2.
2차 대사산물의 analogue 첨가 후에도 2차 대사산물 과잉
생산균 선별
③ trophophase에서 2차
대사산물의 저해에 비감수성 변이주: 변이 처리한 후 고농도의
2차
대사산물 존재 하에서 배양하여 2차 대사산물의 생산성
증가.
④ trophophase에 첨가된 유독성
전구물질에 대한 비감수성 변이주
예)
Penicillum chrysogenum에 의한 pencillin 생성시 전구체인
phenyacetic acid는
유독성
물질임. 이 물질에 저항균은 pencillin 생산성 증가
3) 복귀변이주: feedback
regulation의 해제에 의한 2차 대사산물 과잉생산
①
2차 대사산물의 생산에 연관된 1차 대사산물을 요구하는
영양요구성 변이주의 복귀
변이주:
교차경로와 이중변이에 의한 feedback regulation의 해제
② 2차 대사산물의 생산능을 소실한 변이주의
복귀변이주
상업적 생산에서는 공정 설계,
채산성을 검토: 생산물 수율 외의 산업적 생산에 적합한
균주의 성질 요구 예) 균의 안정성, 산소 요구성,
감염에 대한 저항성, 배지 성분에 대한 허용성, 거품의
생성, 바람직하지 않은 부산물 생산, 형태학적 문제 등
1) 안정한 균의 선별
① 높은 생산성 균주의 안정성: 보존과 배양
모두에서 중요, 이중 배양과정 중에 자연
복귀
변이주 생성
② 빠른 균주 사용: 생육속도가 빠르고 생산성이
낮은 균주가 생육속도가 느리고 생산성이
높은
균주보다 우선
③ 여러 번 돌연변이된 균주 사용: 모든 변이가
동시에 상실될 가능성이 적다.
예) Corynebacterium에
의한 lysine 생산: homoserine 단독 영양요구주보다 homoserine
과
threonine 이중 영양요구주가 생산성도 높고 복귀도 잘
안 된다.
④ 균주 안정화: 균주를 계속하여 선별한 후
역가가 일정 할 때 사용
⑤ 사면 대 사면 이동(slant-to-slant transfer):
균주가 불안정하면 2차 slant에서 수율
이
떨어지고 이 slant는 폐기한다. 이 과정을 반복하여도 역가가
떨어지지 않는 것을
사용한다.
⑥ 재조합 미생물의 불안정성(plasmid)
1. 분리 유실: 일정하지 않은
분배로 plasmid가 없는 딸 세포 발생
->
vector를 염색체상의 DNA에 삽입
2. 구조적 불안정성: 세포가 자신에
대한 해로운 영향을 절감시키기 위해 plamid가
변형됨
예) 항생제
저항은 세포에 유용하지만 외부 단백질의 생산은 세포에게는
전혀 유용하
지
않다. -> 외부 단백질의 생산 관련 유전자만 제거됨
3. 성장속도에 의한 불안정성:
plasmid가 없는 세포가 plasmid가 있는 세포보다 빠르다.
->
선택압력 사용: 항생제 첨가(plasmid가 없는 세포 사멸)
2) 감염 저항균 선별
phage 내성균을 선별: 변이된
phase의 발생으로 반드시 phase를 방지할 수는 없다.
① 공장 내 청결
② phage의 증식을 선택적으로 저해하는 약제
첨가
③ 여러 가지 항생물질 내성균 선별: 항생물질
첨가
④ 숙주 제한 및 변형계(host-restriction
and modification system; HRM): HRM을 숙주에
cloning하면
숙주의 도입된 외래 유전자는 파괴하지 않고 세포 안에
들어오는 외래 핵
산만
파괴
3) 거품을 생성하지 않는
균 선별
① 거품: 생산물을 공기 출구를 통해 소실
시킴, 오염의 위험도를 증가시킴
② 발효 초기 거품: 배지 성분이 원인
발효 말기 거품: 균의 성질이
원인
③ 방법: 돌연 변이주 선별, 유전자 재조합,
세포 융합: 거품이 없고 생산력이 낮은 균과
거품이
있고 생산력이 높은 균을 이용
4) 배지 성분의 변동에
강한 균 선별
① 배지 성분중 독성 성분에 대한 저항균:
예) Penicillin 생산에서
의 phenylacetic acid
② 고농도 배지 성분 내성균:
예) 항생제 발효(oxytetracycline)에서
고농도 인산 내성균을 선별 후 고농도 CSL 사용
③ 배지 성분의 analouge를 사용하여 배지
성분 저항균:
예) oxyglucose를 사용하여
glucose catabolite repression 저항균 선별
5) 좋은 형태의 균 선별
① 미생물의 형태: 공정 조작(통기 효과, 여과성)과
운전 비용에 영향을 준다.
② 미생물 형태의 조절: 접종량, 배지조성,
균주의 특성
③ 저점도 균: 산소 이동 속도 향상
④ 유전자 재조합법: 특수한 형태의 균을 선별하는데
돌연변이법보다 유리
⑤ 세포 융합:
1. cephalosporin 생성균:
포자형성능이 없고 성장속도가 늦고 고생산성 균과 포자형성
능이
있고 성장속도가 빠르고 저생산성 균의 원형질 융합 ->
포자형성능이 있고 성
장속도가
빠르고 고생산성 균를 얻음.
2. penicillin 생성균:
pellet 형성 균을 얻음
⑥ 맥주공장에서의 천연균주 선별: 효모의
응집화(flocculation)
상면발효에서는 최초로
부상하는 효모 선별, 하면발효에서는 최초로 침강하는 효모
선별
6) 낮은 산소 분압에서
견디는 균 선별
제작비 및 운영비 절감
7) 불필요한 부산물이 생기지
않는 균 선별
① 색소를 생산하지 않는 변이주 선별: Penicillin
생산에서 색소를 제거하여 추출공정이 간소화됨
② 고농도의 균체를 얻기 위해서는 초산의
생성이 제거된 균주 선별:
1. 초산 생성효소인 phosphotransacetylase의
활성을 억제하거나 또는 생성를 차단
2. 초산을 독성이 약한
에탄올, acetoacetate, 2,3-butandiol과 같은 대사산물로
전환
3. 낮은 농도의 산소에서
세포 성장을 향상시키고 초산 생성을 줄이기 위하여 세균의
hemoglobin
유전자를 발현
4. 기질 소모 속도를 낮춤:
기질 수송 단백질의 효율을 낮추기 위하여 glucose
permease와
같은 기질 수송 단백질을 변이 시킴.
8) 새로운 산물을 만드는
균 선별
① 전구물질 analogue 첨가: 최종산물의 analogue를
얻음. 생성된 최종생산물에 편입되는
경우
존재
② 돌연변이 생합성 (mutational biosynthesis):
replica plating법을 사용하여 변이 처리
균을
전구물질만 존재하는 plate에서 민감균에 대한 생육저지력이
큰 것을 선별하여 새
로운
산물(항생제)를 생산하는 균을 선별
③ 세포 융합: 다른 대사물질을 생산하는 두
균주를 원형질 융합 시켜 새로운 대사물질 생
산
④ 유전자 재조합: 다른 대사물질을 생산하는
유전자를 대사물질 생산 균에 도입
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