무균제제의 생산 공정에서는 무균 공정 환경, 무균 시험 환경 및 무균조작 장비의 멸균이 아주 중요하다. 기존에 사용해 오던 포르말린 훈증, 과초산계열의 훈증, 그리고 과초산과 과산화수소를 섞은 용액의 훈증, 혹은 에어로졸의 살포 등은 멸균 후 남아있을 수 있는 잔류물의 독성 문제, 멸균 후 이를 제거(청소)해야 하는 문제, GMP에 만족하는 밸리데이션 수행이 어렵다는 점 등 때문에 사용을 금지해가고 있는 것이 선진국의 추세이다.
최근에는 멸균작업 후 잔류물이 남지 않아 청소할 필요도 없고 그러므로 잔류물의 독성을 염려할 필요도 없는 과산화수소 증기를 이용한 멸균법이 개발되어 환경은 물론 제조용 특수 장비의 멸균에 널리 사용되기 시작하였다. 또 이 방법은 밸리데이션이 가능하므로 GMP 요구조건도 만족 시킨다.
1.1 왜 과산화수소 증기(Hydrogen Peroxide Vapour, HPV)인가?
과산화수소 증기를 이용한 미생물의 멸균방법은 멸균 후에 남는 물질이 H2O와 O2 뿐이므로 독성이 없고, 의약품 제조공정에서 사용되는 기계 장치 및 기타 멸균대상물 자체에는 거의 영향을 미치지 않는다. 이런 이유로 최근, 미국, 유럽 등지에서 기존의 잔류독성을 남기는 훈증방법을 대체하여 안전한 멸균 방법으로 각방 받고 있다.
2H2O2 --> 2H2O + O2
화학물질을 사용하는 소독방법과 달리 액체상태나 액체방울상태가 아닌 증기라는 기체 상태로 분사시키므로 사람 손이 닿기 힘든 공간과 표면의 구석구석까지 전달되어 환경의 멸균과 동시에 기기표면도 멸균이 가능하다. 또한 멸균력이 뛰어나 일반 소독제로는 제거할 수 없는 미생물의 아포(spore)수준까지 멸균할 수 있다.
잔류물을 남기는 기존의 훈증멸균법(포름알데히드, 과초산, 과초산과 과산화수소의 혼합물(Dry fog) 등은 그 잔류물에 의해 피멸균물질에 악영향을 미칠 수 있을 뿐 아니라 작업자의 건강에도 악영향을 미친다.
이들 여러 가지 멸균법을 비교하면 다음 표와 같이 정리할 수 있다.
<멸균방법 특징 비교>
1.2. 미생물을 어떻게 사멸시키는가?
과산화수소 증기는 높은 온도로 가열되어, 멸균하고자 하는 공간으로 전달된다. 과산화수소 증기는 멸균하고자 하는 공간의 과산화수소 증기 농도가 이슬점에 도달할 때까지 공급된다. 이슬점에 도달한 과산화수소 증기는 차가운 표면에 응축(condensation)되기 시작한다. 과산화수소 증기의 응축액이 표면에 붙으면서 free radical을 방출하여 멸균이 신속하게 시작된다.
<미세응축액 형성 모형도>
1.3. 멸균력을 어떻게 측정하는가?
미생물에 대한 과산화수소 증기의 멸균력은 일반적으로 과산화수소 증기에 저항을 가지고 있는 미생물을 이용하여 측정한다.
Geobacillus stearothermophilus가 과산화수소 증기에 대한 강한 저항력이 있기 때문에 생물학적 지시자(biological indicator, BI)로 이용되고 있다. 이 균은 자연에 분포하는 다른 미생물에 비해 몇 배나 더 강한 저항성을 가지고 있으나 병원균은 아니다. BI는 주로 균의 포자 형태를 이용해 만들며, 스테인리스스틸의 작은 조각에 접종하는데 최소 100만개의 포자를 접종한다. 멸균의 수준은 멸균공정이 끝난 후 이 BI를 배지에 넣어 배양한 후 균의 생존여부를 판단한다. 6-log 감소(106에서 100로 감소)를 일반적인 멸균보증수준으로 받아들이고 있다.
과산화수소 증기를 이용한 멸균은 처음에 존재하는 균의 수가 1/10로 감소하는 시간을 나타내는 D-value가 2분 이내로 굉장히 빠른 생물 불활성을 나타내며, 포자(멸균과 살균 물질에 가장 강한 저항성을 가지고 있는 것은 포자를 형성하는 박테리아)에 대해서도 6-log 감소가 빠르게 이루어진다. 과산화수소 증기를 이용한 멸균에서의 생물학적 효율에 대해서는 다음 강좌에 자세하게 설명하도록 하겠다.
첨부하는 자료에서 과산화수소 멸균용 Biological Indicator에 관한 이해를 도모하기 바란다.
<참고자료>
과산화수소 증기 멸균용 생물학적 지시자(Biological Indicator, BI)
과산화수소 증기 멸균의 생물학적 지시자(biological indicator, BI)는 Geobacillus stearothermophilus 균주를 1.0 x 106개 이상 접종한 스테인리스 스틸로 된 토큰을 사용한다. 이 BI를 과산화수소 증기 발생기에 의해 생성되는 과산화수소 증기에 의한 생물학적 비활성화시스템(멸균 시스템)에 노출시키고 비활성화가 제대로 되는지 확인하는 것을 사이클 밸리데이션(cycle validation)이라 한다.
1. BI 균주로서 Geobacillus sterothermophilus의 적합성
Prion(프라이온-여기에 관해서는 좀 더 연구가 이루어져야 하며 전문적으로 말하자면 살 아있는 미생물이 아니다.)과 coccida(수인성 병원체 Cryptosporidium을 포함한 원생동물 그룹)의 이용가능성을 제외하면, 살아 있는 균 중에서 멸균과 살균 물질에 가장 강한 저
항성을 가지고 있는 것은 포자를 형성하는 박테리아이다(McDonnel & Russell. Clinical Microbiology Reviews, 12:147-179 (1999). Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action and Resistance, 멸균과 살균물질 : 활성화, 작용, 저항성)
Geobacillus stearothermophilus는 과산화수소 증기에 대해 가장 큰 저항성을 가진 미생 물로 알려져 있다(Kokubo, M, Inoue, T, Akers, JPDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 52, 228-231(1998) Resistance of common environmental spores of the genus Bacillus to vapor hydrogen peroxide 주위 환경에 흔히 존재하는 Bacillus속의 H2O2증 기에 대한 저항성). 그리고 제약회사 및 USP에서 멸균과정에 대한 표준(기준)은 Geobacillus stearothermophilus 포자의 6 log 감소(균수가 106에서 100로 감소)를 수행 하는 것이기 때문에 BI의 균주로 Geobacillus sterothermophilus를 사용하는 것이 적합하다. .
2. D값들의 비교*
(Information supplied with kind permission of Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana.
인디애나주, 인디애나폴리스 에 있는 Eli Lilly and Company의 허가를 받아 기재함)
<각 미생물의 D값 비교>
* D값은 균(아포)의 수가 1/10로 감소하는데 필요한 시간이다. (즉 살아있는 균의 수가 처음의 10%가 되는 것을 말한다. 예를 들면 100에서 10으로 감소하는 것이다.)
위에 나타난 D값은 최소한 3번 정도 멸균 사이클을 돌린 후 평균 값을 분(分)으로 나타낸 것이다.
G. sterothermophilus 가 가장 큰 D값을 가지고 있다는 것은 가장 멸균되기 힘들다는 것을 의미한다. 그러므로 BI의 균주로 선택하는 것이 가장 적절하다.
3. 서로 다른 재료(carrier)에 대한 G. sterothermophilus 균주의 저항성(D값) 실험
<접종 재료(carrier)에 따른 D값 비교>
스테인리스스틸(Stainless Steel)의 D값이 1.7분으로 ULTEM, Polyurethane과 함께 저항성이 큰 접종 재료(carrier)이므로 BI 접종 재료(carrier)로 선택하였다.
- 본 자료의 경우 본인이 근무 중인 회사 대표님께서 국내 최대의 GMP 사이트인 sureGMP에 올리신 강좌입니다.
원문 확인을 위한다면, http://www.suregmp.com/academy/academy_contents.asp?serialid=534&odr=1 에서 확인 가능하십니다.
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