효소의 고정화 방법을 논하라.
1) 고분자 매트릭스막 속에 효소를 포괄적으로 고정화하는 방법
2) 효소를 막에 물리적으로 흡착시키는 방법
3) 고분자 막 또는 무기담체막에 효소를 공유결합시키는 방법
4) 효소끼리 서로 가교화하여 막 모양으로 형성하는 방법
(1) 포괄법(가두기)
포괄법(entrapment)은 중합체로 망상구조를 만들고 효소를 이 가교된 중합체 안에 가두어 고정하는 방법(격자형)과 반투막인 고분자의 엷은 막으로 된 미세캡슐(microcapsule) 안에 가두는 방법(microcapsule형)이 있다.
효소 고정화를 위하여 사용되는 격자는 보통 Ca-알진산염(Ca-alginate), 아가(agar),κ－카라지난(κ－carrageenin), 폴리아크릴아미드, 콜라겐(collagen)과 같은 고분자이다.
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Calcium alginate (C6H7Ca1/2O6)n
Stabilizer, thickener, gelling agent, emulsifier
효소를 고분자 격자 속에 고정화시키기 위해서는 효소용액을 고분자 용액에 혼합하여 중합반응을 시킨다. 그리고 액체상의 고분자－효소 혼합물을 입자형태로 만들기 위하여 중합된 겔을 사출하거나(extrude) 주형내에서 중합한다. 미세캡슐화(microencapsulation)는 미세하면서 속이 빈 다공성막(porous membrane)으로 구(球)를 만들어 효소액을 그 내부에 담는다.
포괄법의 경우에는 효소가 막 안에 고정화되어 있기 때문에 기질의 확산이 반응의 율속단계(rate limiting step)가 되는 경우가 자주 있다. 따라서 고체 겔의 입자 크기를 작게하거나 효소 고정화 막을 얇은 막으로 만든다.
(2) 흡착법
흡착(adsorption)이란 효소가 반데르발스 힘 또는 분산력과 같은 약한 물리적 힘에 의하여 지지입자의 표면에 부착하는 것이다. 효소흡착에 사용되는 지지물질로는 무기물질, 유기물질 및 이온교환수지가 있다. 무기물질에는 알루미나, 활성탄, 실리카, 세라믹, 다공성 유기, 규조토 등이 있다. 유기물질로는 활성탄, 전분, 셀룰로오스 등이 있고 이온교환수지에는 엠버라이트(Amberlite), 세파덱스(Sephadex), 다우엑스(Dowex) 등이 있다.
(3) 공유결합법
공유결합법이란 효소를 공유결합에 의해 지지물질의 표면에 부착시키는 것이다. 일반적으로 효소는 아미노기(-NH2), 카르복실기(-COOH), 수산화기(-OH), 황화수소기(-SH) 등 아미노산 잔기를 가지고 있다. 이들 잔기와 막 표면에 노출되어 있는 기능기를 공유결합시켜 효소를 막에 고정화한다. 예를 들면, 지지체의 카르복실기와 효소의 아미노기를 펩티드 형성 반응으로 결합시킬 수 있다. 지지체의 수산기 등은 시안브롬(BrCN) 등으로 활성화시킨 후에 효소를 결합시킨다. 또 아미노기 등을 가지는 막의 경우에는 2개의 기능기를 가지는 글루타르알데히드 등과 반응시켜 시프-베이스(shiff-base)를 형성시켜 여기에 효소를 결합시키는 방법이 널리 이용된다.
(4) 가교화법
가교화법이란 효소와 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 등 저분자량 물질을 공유결합시켜 가교를 형성하는 방법이다. 아미노기를 가지고 있는 담체에 효소 용액과 글루타르알데히드를 반응시키면 효소와 담체 사이, 혹은 효소분자 사이에 가교반응이 일어나 효소가 막 위에 고정화되는 방법이다.
담체가 아미노기나 수산기와 같이 가교화될 수 있는 기능기가 없는 경우에는 효소와 함께 알부민 등의 단백질을 동시에 반응시킨다. 그러면 효소와 단백질 중의 아미노기가 반응하여 효소-효소, 효소-단백질, 단백질-단백질 등의 복잡한 반응이 일어나 불용성 망상구조가 생성되어 겔 모양의 고정화 효소를 얻을 수 있다.