식물과 철
1. 서론 : 식물에서 철의 기능
철은 중요한 생화학적 반응을 촉매하는 약 140개 효소들의 조요소로서 식물의 성장과 발달에서 핵심적인 역할을 하며, 생합성 경로의 여러 단계에서 필요하다. 엽록소 생합성은 식물의 철의 순생리 이용성 지표로서 생각되고 있으며, 철의 생리작용은 생체 내에서 단백질, 아미노산, 핵산등과 같은 배위자(ligand)와 결합하여 착염을 형성하려는 성질과, 원자가 변화(Fe+2, Fe+3)에 의하여 전자 전달을 행하는 성질에 의한 것이다. 철은 시토크롬(cytochrome, 세포 구성성분인 헴단백질의 일종)류, 카탈라아제(catalase, 과산화수소가 물과 산소로 분해되는 반응을 촉매하는 효소), 페록시다아제(peroxidase, 과산화 수소를 전자 수용체로서 기질을 산화하는 효소)등 헴(heme)계 효소와 엽록체 안 또 다른 철단백 형태인 ferredoxine(철-유황 단백질) 이란 물질에 존재하여, 전자수송의 역활을 하면서 산화 환원을 일으키며 2가(Fe+2) 또는 3가(Fe+3)이온의 형태로 흡수되고, 식물체 내에서는 대부분(80%이상)엽록체에 피토페리틴(phytoferritin, 잎의 철 결합단백질)이란 물질로 존재하여 광합성 작용에 필요한 색소체 발달에 요구되는 철을 공급해주고 있다.
철은 엽록소의 구성 성분은 아니나 엽록소의 생합성 과정에 필요한 원소이므로 부족하면 잎에 독특한 황화현상이 나타난다. 철의 결핍으로 엽록소의 생성이 감소되는 것은 마그네슘의 결핍증과 같으나 철은 이동성이 좋지 않은 편이므로 마그네슘과 달리 어린 잎 쪽에서 나타난다. 새잎의 엽맥 간 황화현상이 진전되면 점차 백색으로 된 다음 빨리 죽는다. 철은 토양 중에 많이 존재하고 있어 별로 문제되지 않으나 식물로의 흡수가 억제되거나 체내의 이동,
특히 뿌리에서 지상부로의 이행이 방해되는 경우 결핍증이 발현된다. 즉 중금속(특히 Mn, Cu)의 과잉, 석회 과다로 pH 상승, 작물체 내에 인산 이온이 고농도로 많을 경우 철의 흡수 이동이 방해된다.
철의 생체항상성(homeostasis)의 정확한 조절은 세포의 원활한 기능을 위한 기초적 필요조건이다. 철분(Fe2+)은 미량원소로서 적은 량이 필요하지만 결핍은 매우 심각한 문제를 야기할 수 있다. 식물체내 미량원소의 흡수, 이용은 1) 뿌리에 의한 미량원소의 흡수, 2) 뿌리로부터 지상부로의 이동, 3) 저장기관으로의 부위별 재이동 및 저장 과정에서의 효율성에
의하여 좌우되고 있다. 따라서 이러한 과정에서 일어나는 제반 생리적 반응들이 활성화되도록 유전자 등 제반 기능을 강화시키는 것이 궁극적으로 철분과 같은 미량원소의 흡수 및 저장에 매우 중요한 역할을 할 것이다.
2. 본론
가. 철 부족 현상의 원인
우리가 철분이 부족하면 빈혈에 걸리는 것처럼 철은 식물에서도 산소의 이동, 여러 효소의 작용, 핵산의 복제 등 생리 작용에서 꼭 필요한 영양소이다. 철은 지구상에서 네 번째로 풍부한 원소인데, 어떻게 모자랄 수가 있을까? 우리가 사는 환경에서는 산소가 존재하기 때문에 철의 용해도가 아주 낮아 섭취하기가 어렵다. 인체의 경우는 철을 페리틴(ferritin)과 같은 복합 단백질 등으로 저장해 놓고 필요할 때 이용한다. 미생물은 생장을 위해서 철을 필요로 하지만 산화된 제2철 이온은 대부분 광물 형태로 존재하기 때문에 미생물이 이를 직접 이용하기가 어렵다. 미생물은 이 문제를 어떻게 해결했을까? 지구 생성초기 대기에는 산소가 없었고 환원된 형태인 제1철 이온은 용해도가 낮지 않기 때문에 미생물이 철을 이용하는데 아무 문제가 없었다. 그러나 광합성에 의하여 점점 산소가 증가되고 녹아있는 철은 점점 귀해져서 미생물들은 생존에 어려움을 겪게 된다. 그리하여 미생물들은 철을 직접 녹여 세포내로 이동시킬 수 있는 시데로포어(SIDEROPHORE)라는 유기물질을 자체적으로 만들기 시작하였다. 이에 따라 시데로포어는 철(Sidero)의 이동자(phore)라는 의미가 되었고 현재 약 300개 이상의 구조가 알려져 있다. 미생물이 생장을 위해서 철이 필요하면 시데로포어 생성 관련 유전자에 의한 단백질의 발현을 통하여 시데로포어 분자를 조립한다. 세포질에서 만들어진 시데로포어는 철이 필요할 때 세포 밖으로 분비되어 시데로포어-제2철 결합체를 형성함으로써 철의 용해도를 높인다. 이 결합체는 다시 미생물의 막단백질을 통하여 세포내로 이동되고 미생물은 철을 이용할 수 있게 된다. 대부분의 박테리아는 숙주 내에서의 감염의 유지, 성장, 생존을 위해서 Fe을 절대적으로 필요로 하며, 생존에 필요한 Fe을 획득하기 위하여 박테리아는 siderophores(iron chelator)를 분비한다. 시데로포어는 미생물뿐만 아니라 식물에서도 발견되며 인간의 면역세포와도 상호작용을 하는 것으로 알려져 있다. 시데로포어의 연구가 흥미로운 것은 이들이 질병과도 관계가 있다는 점이다. 심장병, 암 등 무서운 병이 많지만 아직도 세균 감염에 의한 사망률도 크게 개선되고 있지 않고 있다. 만약 세균들이 만드는 시데로포어 생성을 억제시키는 기술이 있다면 이들에 의한 감염을 줄일 수 있다. 항생제의 남용 등으로 인해 항생제에 내성을 갖는 미생물이 늘고 있는 것도 하나의 문제점이다. 항생제의 내성의 원인 중에 하나는 미생물이 세포로 흡수된 외부물질을 세포 밖으로 배출시킬 수 있는 능력이 있기 때문이다. 반대로 약물의 전달 방향을 세포 밖에서 세포안쪽으로 촉진시키면 항생제의 효과를 높일 수 있을 것이다. 이러한 점을 이용해 시데로포어와 항생제를 결합시킨 미생물의 자살유도 항생제가 연구되고 있다. 철이 고픈 질병균들은 Fe(III)-시데로포어-항생제 복합구조를 자신이 내보낸 시데로포어인 줄 착각하고 세포내로 받아들인다. 영양제가 아닌 사약을 먹은 이들의 운명은 여기에서 끝이다. 미생물의 능력은 놀랍기만 하다. 하지만 더욱 놀라운 것은 이것을 역으로 이용하는 과학자들의 능력이다.(x-science에서 부분 발췌하여 수정 보완함)
나. 식물의 철분 흡수 모델
토양 내에서 철은 자연 pH 하에서 용해도가 낮아 안정된 상태로 존재하고 있다. 대부분 호기성 토양 (aerobic soils)에서 자란 식물들에서 철분결핍의 주요 원인은 Fe(III)-oxides의 불용성 때문이므로, 근권에서 뿌리와 미생물의 산화력이나 pH 변화는 식물 종들에 있어서 뿌리의 철분이용 정도에 크게 영향을 미친다.(Bienfait 1989; Moraghan and Mascagni 1991).
식물에 있어서 철분의 흡수, 이동에는 3 가지 모델이 제시되고 있는데, 모델1(StrategyⅠ)에는 쌍자엽 식물과 단자엽 식물이 속하며, 뿌리세포로 철분의 유입, 유기산(organic acid), 환원제(reductants) 와 철이온(H+ -ions) 및 Fe3+- 킬레이트 환원효소(chelate reductase) 등으로 구성되며, 모델2(Strategy Ⅱ)에는 벼과(Poaceae) 속 식물들이 속하며, 뿌리 세포로 철분의 유입, phytometallopheres의 방출 및 metal-phytometallophere 복합체의 유입 등으로 구성되고, 모델3(Strategy Ⅲ)에는 모든 고등식물들이 속하는데 미생물 메탈로포어(microbial metallophore)-metal 복합체로 구성되어 있다. 모든 식물에서 니코티아나민 합성 유전자(nicotianamine synthase)는 철 섭취 메커니즘(iron uptake mechanism)에서 중심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있는데, chloronerva mutant(클로로너바 돌연변이체)는 니코티아나민(nicotianamine)을 합성하지 못하므로 철분의 결핍을 초래하여 엽맥간 황백화(intercostal chlorosis)를 일으킨다. 따라서 철분의 흡수를 위해서는 니코티아나민 합성 유전자(nicotianamine synthase)의 작용을 필요로 한다.(Hong et al. 1999).
벼과(Gramineae)를 제외한 모든 고등식물들은 모델1(strategy I) 철분흡수 기구에 의하는 것으로 알려져 있다. 그 주요작용은 Fe3+의 용해도를 증가시키기 위하여 근권으로 H+를 분출하는 것과 뿌리 표면에서 Fe3+를 Fe2+로 환원시키는 작용을 하는 뿌리 특별 발현 이온 환원제(root-specific iron reductase)의 작용에 의하여 철분을 뿌리세포 내로 흡수하는 기작으로 이루어진다. 모델1(StrategyI) 종에서 뿌리세포는 표준 환원시스템(standard reductase system)과 뿌리세포 플라즈마 막 환원제(root-cell plasma membrane reductase)의 두 종류의 Fe(Ⅲ)-reductases(3가철 환원효소)를 포함하고 있는데, membrane-bound(막결합) Fe(Ⅲ)-reductases(환원효소)는 plasma membrane(플라즈마 막)의 표면에서 작용을 하는 것으로서 이들 환원제의 활성이 철분의 이용성에 크게 영향을 미칠 수 있다.
모델2(StrategyⅡ) 종 에서는 철분 결핍 조건에서 phytometallophere라고 불리는 low-molecular-weight compounds들이 뿌리세포들에 의하여 합성되는데, S-adenosyl-L-methionine (SAM)과 니코티아나민(nicotianamine)에 의하여 셀룰러 메치오닌(cellular methionine)으로부터 합성되어지며, 이 물질들은 철분과 결합하여 고도로 안정한 hexadentate chelate(여섯자리 킬레이트)를 형성한다.
식물 뿌리세포에 의하여 토양으로부터 Fe2+와 Zn2+ 이온들의 흡수는 뿌리세포 플라즈마 막(plasma membrane)을 가로질러 존재하는 전기 화학적 잠재적 그라디언트(electrical chemical potential gradients)에 의하여 이루어지는 것으로서 이것은 뿌리세포의 플라즈마 막(plasma membrane)에 결합된 H+-translocating ATPase (ATP 가수분해 시에 H+이온을 강하게 공급해 주는 역할을 함)에 의하여 이루어진다 (Welch 1994). 식물체내에서 페리틴(ferritin) 철을 저장하는 단백질로 알려져 있다. 또한 페리틴(ferritin)은 분자량이 약 450kDa의 거대한 단백질로, 하나의 분자당 최고 4,500개의 철원자를 저장할 수 있는 것으로 동물 및 식물뿐만 아니라 거의 모든 생물에 넓게 존재하는 성분이다.
페리틴(ferritin)은 생체 내 주요 철 저장 단백질로서 포유류에서 세균류에 이르기까지 다양한 생명체에 존재한다. 한 분자에 약 2,000개의 3가 철 이온이 결합한 철결합 단백질의 하나로 간, 비장(지라), 골수, 근육 등에 많다. 페리틴(Ferritin)은 24개의 단량체로 구성된 외경 12 nm의 구상 단백질이며, 분자량은 약 480 kDa이다. 생물학적으로는 철을 저장하는 기능을 가진다. 직경 8 nm의 내부 공간에서 수천 개의 철이온을 FeII로부터 FeIII에 산화해, 산화철 미네랄 상태로 퇴적한다. 철 이외에도 여러 종류의 금속 이온이나 유기 소분자를 내부 공간에 집적할 수 있는 것으로 알려져 있다.
따라서 뿌리에서 철분의 흡수 능력을 증대시키고 식물체내에 흡수된 철분을 자일림(xylem)과 철관부(phloem)을 통하여 철분의 이용기관 및 저장기관에 잘 전이 되도록 하기 위하여 Fe(Ⅲ)-reductases와 citrate synthase(시트레이트(구연산) 합성효소) 유전자를 형질 전환시키고 철분을 저장하는 단백질인 ferritin 유전자를 저장기관으로 최대로 발현시키는 것이 필요하다. 자일림(xylem)은 목질부 철관부(phloem)와 함께 도관 조직의 2가지 구성 조직 중 하나로 물을 끌어 당기는 도관 시스템으로 물을 줄기와 잎, 꽃까지 이동시킨다.
철은 DNA 합성, 광합성, 호흡, 질소고정 및 세포내의 전자전달과정에 필수적으로 이용되는 미량원소이다. 따라서, 팬톤반응(Fenton reaction)에 의한 높은 hydroxyl radical 반응이 형성되기 때문에 셀룰러(cellular) 혼합물에 의해 손상이 초래되며 이에 따라 과잉으로 축적되어진다. 철의 생체항상성(homeostasis) 의 정확한 조절은 세포의 원활한 기능을 위한 기초적 필요조건이다. 토양 내 철은 자연 pH하에서 용해도가 낮아 안정된 상태로 존재하고 있다. 식물은 토양 내에 존재하는 철을 뿌리를 통해 섭취(uptake)하는데, 이와 관련된 메카니즘은 식물군에 따라 두가지 전략으로 나누어진다. 쌍자엽과 단자엽의 경우(strategy I), 많은 양자(proton)의 돌기와 황원효소범위 plasma membrane의 유도에 따라 Fe3+에서 Fe2+의 감소 때문에 토양층의 산성화가 증가되고 철의 흡수가 촉진된다. 그러나 모델2(strategy II)의 경우는 토양 안에서 무기네익 산(Mugineic acid) 및 이들 합성물은 Fe 2+ 이온의 킬레이트(chelator)처럼 작동하여 Fe3+ 복합체 같은 뿌리세포에 의해 흡수된다.
다. 철 흡수 유전자
니코티아나민(Nicotianamine, NA)은 식물에 존재하는 금속 원소들과 결합하는 킬레이터(chelator)로, 금속 이온의 흡수, 이동과 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 니코티아나민 합성 유전자(Nicotianamine synthase, NAS) 즉, 니코티아나민 합성효소는 3개의 S-아데노실 메티오닌(S-adenosyl methionine) 분자를 니코티아나민으로 만든다. 모델1(전략 1)식물에서 NA는 심플레스트 경로(symplast) 내, 목질부 이동을 위한 구리의 이동 및 체관부(phloem)이동에서 철의 chelator와 같은 기능을 하고 있다고 알려져 있다. 이들 현상은 모델2(전략2)의 식물에서도 비슷한 역할을 하고 있다고 최근 NA chelate Fe3+ 과 Fe2+ 모두 증명되어졌다. 이들 합성물은 부족한 fenton (시약)반응물, oxidative(산화) 손상으로부터 세포를 보호하는 것도 니코티아나민(Nicotianamine, NA)이 역할을 하고 있다고 암시하였다. 또한 모델2(strategy II) 식물 NA는 무기네익 산(Mugineic acid)군의 피토시데로포어(phytosiderophore; 식물이 분비하는 유기화합물로 Fe3＋에 대한 높은 친화도를 가짐)의 생합성을 위한 전구물질로 작용하고 있어 철 부족아래 니코티아나민 합성 유전자(Nicotianamine synthase, NAS) 활성은 전략1과 2식물에서 다르게 조절기능을 갖고 있다고 하였다. 그럼에도 불구하고, NAS는 전략1과 2 식물 모두에서 철 대사의 조절을 위해 매우 중요한 효소이다. NA의 부족을 나타내는 식물로서 철 대사상에 억제(inhibition)가 있는 토마토 돌연변이체는 어린잎에서 황화현상(chlorosis)이 엽맥 사이에서 나타나고, 뿌리와 shoot(신초)에서 철이 과잉으로 축적되며, 경로(pathway)상에 존재하는 유전자의 발현양상이 정상형에 비해 매우 다른 양상을 보였다. 따라서 이와 같은 다면적 발현은 표현형에 의해 철 부족 증후군이라고 불리우고 있다. 이와 같은 돌연변이체에 외부로부터 철을 시용하면 정상형과 같은 표현형을 보인다. 따라서 철의 섭취(uptake) 메카니즘은 다세포(multicellular) 식물에서 규칙적이며, 다양한 경로에 의해 행해지고 있으며, 체내에 철을 인식할 수 있는 효소로는 니코티아나민 합성 유전자(Nicotianamine synthase, NAS)로 인식되고 있다. Citrate synthase (CS)는 acetyl-CoA와 oxaloacetate(옥살아세트산)로부터 citrate의 형성을 촉매하는 효소로서 미토콘드리아(mitochondria)에 존재하고, TCA 회로상에서 가장 끝에 작용하는 것으로 알려져 있다 (oxaloacetate + acetyl-CoA → citrate + CoASH). 진핵생물에서 citrate synthase(구연산회로)는 미토콘드리아와 과산화소체(glyoxysomes) 내의 동위효소로 알려져 있으며, 분자량이 90kDa이며, 때로는 45kDa의 서브 유니트(subunit)의 분자량을 가진 동일한 크기의 dimer(2분자체, 二分子體))이다. 또한 Mg2+의 존재하에서 식물 glyoxysomal citrate synthase(과산화소체 구연산회로)는 tetramers(4개의 서브 유니트가 결합된 4중합체)를 형성한다. 그러나 대다수의 박테리아에서는 분자량이 280kDa 이상의 것들이 보고 되고 있다. CS 유전자 활성에 영향을 주는 많은 조절요인들로는 NADH, a-oxoglutarate, 5,5-dithi-obis-(2-nitrobenzoic acid), AMP, ATP, KCl 등으로 알려져 있다. 식물, 동물 및 fungi의 미토콘드리아 CS 효소들은 거의 유사한 진화과정을 통해 유전자의 상동성이 매우 높다. 그러나 식물의 glyoxysomal enzyme은 eubacterial 효소의 group으로 분류되나 proteobacterial 이나 cyanobacterial과의 상동성은 거의 없는 실정이다. Aspergillus niger의 경우 특이적인 생장조건하에서 탄소근원으로 sucrose나 glucose을 이용하여 생장배지에 첨가하면 고농도의 citric acid가 축적된다. 구연산생합성을 포함한 대사경로에서 citrate synthase(CS)가 구연산회 로상의 key step으로 생각되어지는데 아마도 회로상의 첫 번째 단계가 무시되었기 때문으로 생각된다. 최근 citric acid 생산에 관련된 탄수화물대사가 많이 연구되어지고 있으며, 유전공학적 수법에 의해 생합성 경로를 이해하려는 시도가 다각적으로 연구되고 있다.
정상식물의 엽중 철분 농도는 80∼200 ppm이며 60ppm 이하에서 결핍 증상을 나타내기 쉽다.
석회 등의 염기가 많아져서 토양 산도가 6.5이상일 때, 인산이 지나치게 많을 때, 뿌리가 상처를 받을 때, 저온 등으로 뿌리의 활력이 저하될 때, 망간 등의 중금속이 과잉일 때 등
철 결핍 발생의 요인은 이와 같이 단순하지는 않다. 흡수하기 어려운 형태로 존재하고 있는
철을 흡수하기 위해 생물체는 세포막에 존재하는 surface ferric reductase4 라는 효소를 이용하여 환원을 시킨 후 ferric oxidase5인 Fet3p 에 의해서 다시 3가 이온으로 산화시킨 다음 세포막에 존재하는 Ftr1 단백질을 이용하여 흡수한다. 이렇게 흡수 된 철 이온은 세포내 필요한 기관으로 전달되는데 세포내에서 이러한 철을 전달해 주는 기작은 아직 연구 중에 있다. 이 과정을 환원성 철 흡수 기작이라고 하며 이 과정에 관여하는 대부분의 단백질을 코딩하고 있는 유전자의 발현은 전사조절인자인 Aft1 단백질에 의하여 조절이 된다. 뿐만 아니라 Aft1 단백질은 구리대사에 관여하는 단백질의 유전자의 발현도 조절을 한다. 흥미 있는 사실은 세포막 단백질인 Fet3p/Ftr1p complex는 ER에서 processing이 일어난 후 세포막으로 이동이 되는데 이때 구리가 중요한 기능을 수행한다. 즉 구리의 세포막 수송체 및 세포내 수송체에 이상이 생겨 구리의 공급이 제대로 이루어지지 않을 경우 Fet3p/Ftr1p는 세포막까지 가지 못하고 ER에 그냥 머물러 있는 것을 확인할 수 있다. 이러한 사실은 철과 구리는 생물체에게 있어서 매우 중요한 금속인 동시에 이 두 가지의 금속은 서로 조화를 이루면서 조절을 받는 것을 의미한다.
(1) Siderophore에 의해 매개되는 철의 흡수
siderophore는 철이 부족한 환경에서 철과 킬레이트(chelate) 결합을 하여 병원균에 철결핍을 일으키는 물질이다. 일반적으로 siderophoresms 토양 내에서의 이온(ion)경쟁, chitinase, glucanase 등 병원균의 균사체를 용해할 수 있는 효소 생산, 항생기능 등으로 식물병원균의 생육을 억제한다. 즉, 시데로포어(SIDEROPHORE0)는 Fe3＋이온의 운반 및 저장에 관여하는, 미생물 등에 의해 생산되는 저분자화합물이다. 결론적으로 친철제 (親鐵劑) Fe3＋이온의 운반 및 저장에 관여하는, 미생물 등에 의해 생산되는 저분자화합물이다.
Siderophore는 대부분의 미생물이 합성해서 분비하는 천연 철 킬레이터이다. 미생물은 철을 필요로 하는 경우 생체내에서 철이 결합되어 있지 않은 apo- 상태의 siderophore를 합성하여 외부로 분비하며 ferric 형태의 철과 결합된 ferric-siderophore는 다시 미생물에 의해 흡수되어 철을 이용하게 된다. 특히 대부분의 bacteria는 철의 흡수를 siderophore에 의존하고 있으며 ascomycetes 곰팡이류는 철의 흡수를 siderophore 및 환원성철 흡수기작 모두를 이용하고 있는 것으로 알려져 있다. S.cerevisiae는 siderophore를 합성할 수 있는 기작을 가지고 있지 않지만 다른 미생물에 의해 분비된 siderophore를 이용하여 철을 흡수하는 기작을 가지고 있다.
(2) ARN 유전자의 검색
S. cerevisiae의 Aft1p는 환원성철흡수기작에 관여하는 대부분의 유전자의 발현을 조절하는 전사조절인자로 알려져 있다. 세포내에 철이 충분히 존재할 경우 철은 Aft1p의 cysteine 잔기와 결합하여 Aft1p가 DNA에 결합하는 것을 막고 따라서 Aft1p는 전사조절인자로서의 활성을 잃게 된다. 이러한 성질을 이용하여 S cerevisiae에서 철 대사에 관여하는 유전자를 찾기 위하여 Aft1p가 항상 활성화되어 있는 dominant mutant AFT1-1up 균주를 구축하였다.
이 변이주는 cysteine 잔기를 phenylalanine으로 치환시켜 철이온이 cysteine 잔기와 결합하는 것을 방지하고 따라서 항상 활성을 지니는 Aft1-1up 단백질을 생산한다. AFT1 유전자가 결손된 균주와 AFT1-1up 유전자를 지니는 두가지의 서로 다른 균주에서 발현되는 유전자의 차이를 보기 위하여 cDNA Microarray 방법을 이용하여 Aft1p에 의해 전사조절을 받는 유전자의 검색을 수행하였다. 그 결과 Aft1p 및 철에 의해 조절이 되는 다양한 유전자를 확인하게 되었다. 이 중에는 기존에 Aft1p에 의해 조절을 받는다고 이미 알려져 있는 유전자 다수와 질소원 대사에 관여하는 유전자의 발현이 Aft1p에 의해 조절받는 것으로 밝혀졌다.
또한 아직 기능이 밝혀져 있지 않은 많은 유전자가 검색되었는데 그 중 막 단백질로 사료되는 유전자 6개가 Aft1p에 의해 전사조절을 받는 것으로 확인이 되었으며 그 중 4개의 유전자 산물의 아미노산 서열이 서로 높은 유사성을 지니고 있었다. 따라서 이 유전자의 이름을
ARN (Aft1 ReguloN)이라 명하였다. 이러한 유전자 산물의 기능을 살펴보기 위하여 각 유전자를 제거하고 그 표현형을 살펴본 결과 특이한 점을 발견할 수 없었다. 그러나 ARN 유전자와 환원성철흡수기작에서 중요한 기능을 수행하는 FET3 유전자를 동시에 제거하였을 경우
siderophore에 결합된 철을 이용하지 못하는 결과를 얻을 수 있었다. 이 과정은 상당히 기질 특이적으로 이루어지며 즉, siderophore의 이용은 Arn 단백질 및 Fet3 단백질 모두가 독립적으로 관여하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과로부터 S. cerevisiae에 의한 siderophore의 흡수는 두 가지의 특이적 경로 즉, Fet3p에 의한 경로와 Arnp에 의한 경로로 이루어진다는 것이 확인되었다.
(3) Surface reductase에 의한 ferric-siderophore의 환원
Fet3p에 의한 siderophore의 흡수는 ferric 형태의 철을 흡수 하는데 이러한 ferric 형태의 철을 자연계의 철로부터 얻기 위해서는 자연계의 철을 먼저 환원시킨 뒤 다시 Fet3p를 이용하여 산화시킨 후 Ftr1p를 통하여 흡수한다. Ferric-siderophore의 경우도 Fet3p/Ftr1p 에 의한 흡수는 먼저 Ferric-siderophore의 환원과정을 필요로 한다. 이를 위해서는 특이적으로 작용하는 ferricreductase를 필요로 한다. S.cerevisiae에서는 이미 surface ferric reductase인 Fre1과 Fre2 단백질 등 2 종류가 알려져 있다. 특히 Fre1p는 철뿐만 아니라 구리에 의해서도 조절을 받는다. S. cerevisiae의 proteome 데이터에는 이러한 surface ferric reductase와 유사성이 높은 5개의 유전자가 더 존재하고 있으며 이러한 유전자의 이름을 FRE3, FRE4, FRE5, FRE6, 및 FRE7으로 명명하였다. 이러한 유전자의 제거를 통하여 siderophore의 흡수와의 연관성을 살펴본 결과 FRE1, FRE2, FRE3 유전자 3 개가 모두 제거되었을 경우 FET3 유전자가 제거되었을 경우와 같은 결과를 보여주었다.즉 FOB의 흡수과정에서 FRE1, FRE2, FRE3 등 3 유전자 산물이 siderophore의 환원에 관여하며 궁극적으로 환원성철대사과정에 관여하는 것으로 사료된다. 이러한 surface reductase 유사 단백질은 그 촉매과정이 매우 특이적으로 이루어지며 언급하였듯이 Fre3p 는 FOB 및 Fc, Fre2p는 enterobactin, 그리고 Fre4p는 rhodotorulic acid에 특이적으로 작용하는 것으로 밝혀졌다.
그러나 siderophore의 reductase 활성을 살펴본 결과 Fre1p 및 Fre2p가 대부분의 활성을 지니고 있다. 즉 90% 이상의 reductase 활성을 가지고 있었으며 나머지 작은 부분을 다른 Fre2p 유사 단백질들이 역할을 수행하는 것으로 사료된다. Plate상에서는 이러한 작은 reductase 활성 차이에 의해서 성장이 전혀 이루어지지 않기도 하고 그 반대로 좋은 상태로 성장을 하기도 한다. 실제로 siderophore의 reductase assay 결과 0.1%정도의 활성 차이가 성장을 결정하기도 한다. 이러한 surface reductase에 의해서 환원된 ferrous 형태의 철은
Fet3p에 의해서 다시 산화된 후 세포막에 존재하는 Ftr1p에 의해 흡수되는 과정을 거치게 된다.
(4) Arn 단백질에 의한 철의 흡수
위에서 살펴본 바와 같이 siderophore의 흡수는 두 가지의 경 로를 통하여 이루어지는데
나머지 한 경로는 Arn 단백질을 통한 흡수과정이다. 이러한 경로는 특이적으로 Arn 단백질이 siderophore와 결합하여 세포내로 흡수된다고 생각 된다. Arn3p의 세포내 위치를 보면
매우 재미있는 사실을 발견 할 수 있다. 즉 대부분의 수송체 단백질은 세포막에 존재하여 물질을 흡수하는데 세포내에 Late-Endosome에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 세포내 Arn3p의 위치를 확인하기 위하여 protease를 세포에 직접 처리하는 실험인 protease protection assay를 수행한 결과 Arn3p는 외부의 protease에 의해 전혀 영향을 받지 않았다. 더욱이 density gradient centrifugation 결과 late endosome의 marker 단백질인 Pep12와 같은 위치에 있는 것을 확인하였다. 또한 immunofluorescence microscopy로 세포내 Arn3p의 위치를 확인 한 결과 late endosome에 위치하는 것이 확인 되었다. 이러한 세포내 위치는 그 동안 생각하여왔던 세포막에서 siderophore를 직접 흡수하는 것이 아니라 다른 mechanism을 통하여 이루어질 수 있다는 것을 유추하게 한다. 이러한 과정을 살펴보기 위하여 세포내에서의 endocytosis pathway가 완전히 결핍된 온도의존성 돌연변이 균주를 이용하여 세포내의 siderophore의 흡수활성을 검토하였다. 그 결과 돌연변이 균주의 경우 높은 온도에서는 정상세포와 비교하여 매우 낮은 흡수활성을 보였으며 세포내의 Arn1단백질의 위치 또한 정상세포와 다른 것을 확인할 수 있었다. 즉 정상세포의 경우 미량의 siderophore를 처리한 후 Arn1 단백질의 위치를 확인한 결과 처음에는 세포막에서 확인되었지만 그 후 다시 세포내로 들어가는 현상을 확인 할 수 있었다. 그러나 돌연변이 균주의 경우 세포막에 그대로 남아있고 세포내로 들어가는 현상을 찾아보기 힘들다. 이는 결국 세포내 endocytosis pathway가 siderophore의 흡수에 중요한 기능을 수행하는 것을 보여준다.
(5) 세포벽 단백질에 의한 siderophore의 결합
cDNA microarray 결과 철 및 Aft1p에 의해 조절을 받는 유전자 중 세포벽에 존재하는 단백질 3개 (FIT1, FIT2, FIT3)가 검출이 되었다. 그러나 이러한 단백질의 siderophore의 흡수와 연관을 짓기는 그리 어렵지 않다. 대부분의 Gram(-) bacteria의 경우 siderophore를 흡수하기 위해서 세포벽에 존재하는 당단백질과 siderophore의 결합이 이루어지고 그 후 특이적인 막단백질인 Fhu 단백질에 의해 흡수가 이루어진다.이러한 연구보고는 S. cerevisiae에서도 세포벽 당단백질과 siderophore사이의 결합이 이루어지고 그 후 특이적인 수송체 및 환원성철대사과정에 의하여 철이 흡수되리라 가정할 수 있다. 이러한 가정을 확인하기 위하여 FIT1, FIT2, 그리고 FIT3유전자를 조합을 맞추어서 1개부터 3개까지의 유전자 모두를 제거하고 siderophore의 흡수활성을 검토 한 결과 약간의 차이를 확인 할 수 있었다. 그러나 그 활성 차이가 크지 않아 Fit1, Fit2, Fit3 단백질의 siderophore와의 결합력을 측정하였다. 즉 siderophore와 cell을 미리 결합을 시킨 후 zymolyase 처리를 통한 세포벽제거를 수행한 뒤 세포벽과 함께 떨어져 나오는 siderophore의 양을 측정하였다. 그 결과 FIT 유전자가 제거된 균주의 경우 세포벽으로부터 떨어져 나오는 siderophore의 양이 상대적으로 적은 것을 확인하였다. 이러한 결과는 Sed1 단백질의 연구결과와도 일치한다. Sed1 단백질은 세포벽에 위치하는 당단백질로서 이 유전자를 제거한 경우에도 세포벽에 결합하고 있는 siderophore의 양은 감소하는 것으로 보고 되었다. 다만 이러한 세포벽 당단백질 모두를 제거할 경우의 연구 결과는 아직 보고되지 않았다. 그러나 이러한 결과로부터 세포벽에 위치하는 당단백질은 S. cerevisiae의 siderophore의 흡수과정에서 결합을 하는 중요한 기능을 가지는 것으로 사료된다.
3. 결론
Siderophore는 미생물들의 철의 흡수에 있어서 매우 중요한 기능을 수행하는 천연 킬레이터로서 대부분의 미생물들은 이러한 물질을 합성하여 다시 흡수하는 기작을 가지고 있다.
S.cerevisiae는 siderophore를 생합성 하는 기작을 가지고 있지 않지만 다른 미생물에 의해 합성되어 분비된 sideorphore를 사용할 수 있는 기작을 지니고 있다. 이러한 siderophore의 흡수는 ARN 유전자에 의해 코딩되어있는 Arn 단백질에 의해서 특이적으로 흡수되지만 siderophore에 의해 결합되어 있는 철을 환원시켜 환원성철 대사과정으로 대표되는 Fet3/Ftr1 protein에 의해 흡수되는 과정 또한 지니고 있다 (Fig. 2). 이는 S. cerevisiae가 독립적인 2가지의 기작을 이용하여 철을 흡수하는 것을 의미한다. 이러한 흡수 기작
특히 Arn 단백질에 의해 매개되는 과정은 아직 밝혀야 할 부분이 많이 남아있다. 즉 곰팡이의 일종인 Ustilago maydis의 경우는 siderophore를 철과 결합된 상태로 직접 흡수하지만
S. cerevisiae의 경우는 아직 밝혀져 있지 않다. 이는 안정한 형태인 형광이나 방사선동위원소가 결합된 siderophore를 얻지 못하였기 때문인데 현재 연구가 진행 중에 있다. 또한 포유동물의 대장에는 Enterobacter sp. 가 다량으로 존재하는데 위 미생물은 enterobactin이라는 siderophore를 합성 분비하고 있다. 따라서 포유동물에서 siderophore 흡수 기작을
연구하는 것도 재미있는 부분이라고 사료된다. 이러한 siderophore는 현재 의학적으로 많이 이용되고 있지는 않지만 장기적으로 철과 병원성 과의 연관관계가 매우 높기 때문에 병원균의 철 대사과정을 억제 하는 물질로서 병원성을 저해시키는데 활발히 이용되리라 사료된다.
Siderophore는 철이온(Fe3+)과 친화성이 높은 가용성이며 저분자(1.0 kDa 미만)인 2차 대사산물로 많은 미생물들이 이 물질을 생산한 후 철수송계(high-affinity iron-transportsystem)를 이용해 토양환경 내 철이온(Fe3+)을 흡수하여 생육에 이용한다.
식물의 성장을 증진하는 능력을 가진 PGPR 세균은 대부분 Pseudomonas로 알려졌지만
Anthrobacter, Alcaligenes, Serratia, Rhizobium, Agrobacterium과 Bacillus 등도 보고된 바 있다. 식물 호르몬 분비에 의한 식물 성장촉진 및 신속한 colonization에 의하여 식물 뿌리 부근에 aggregation 되어 식물병의 침입을 막는데 이는 siderophore를 생성하여 병원균이 이용할 철분을 흡착함으로써 병원균의 생육을 저해하는 것으로 알려졌다. 미생물이 생성하는 siderophore는 세균에 의한 catecholate형과 세균이나 곰팡이가 생성하는 hydroxamate형이 있는데 미생물이 생성하는 siderophore는 간접적으로는 착합된 철을 해리시켜 식물체의 철 양분에 기여하기도 하고 직접적으로는 철과 결합한 siderophore를 그대로 흡수하여 철 양분에 기여하기도 한다. 귀리나 해바라기, 사탕수수 등은 미생물이 생성하는
hydroxamate siderophore를 직접 이용할 수 있으나 여러 종류의 siderophore 중에서
ferrioxamine B나 rhodorulic acid가 가장 쉽게 이용된다. 철의 결핍을 극복하기 위해
Legionella, Neisseria, Lactobacillus, Saccharomyces 등을 제외한 모든 호기성 혹은 통성 호기성 미생물은 주위의 철을 흡수하기 위해 siderophore를 생성한다. 특히 식물 근권에서 철의 이용도에 따라 미생물의 생육과 발달이 영향을 받기 때문에 미생물이 생성하는 siderophore는 토양병원성 미생물이나 식물 생장 촉진에 중요한 biological control제로 사용되어왔다. 그러나 실제로 식물병을 생물방제하려는 대부분의 노력이 한 가지 병원균에 대하여 한 가지 생물방제 인자만을 사용함으로 만족스러운 결과를 얻지 못하였다. 생물방제제가 만족스러운 결과를 얻기 위해서는 환경을 경쟁 미생물 군에게는 불리하게 만들거나 뛰어난 생물방제활성을 갖는 균주 혼합제를 개발하여야 한다. 이를 위하여 식물 정착 양상이 다른 미생물의 혼합, 다른 병원균을 방제하는 미생물을 혼합, 병 억제기작이 다른 길항균의 혼합, 분류학적으로 다른 미생물의 혼합, 식물정착에 대한 최적 온도, pH, 습도조건이 다른 미생물의 혼합 등이 있으나 선결과제는 공 접종하는 미생물들끼리 화합성이 있어야 한다.
근권세균은 식물의 뿌리에서 생산되는 분비물과 분해산물을 영양원으로 살아가며따라서 뿌리 표면에는 다양한 근권세균들이 존재한다. 이들 균주 중 식물 생육 촉진근권세균(PGPR)은
뿌리의 표면이나 내부에 기생하면서 근권내에 서식하는 식물 생육저해균(deleterious micro-organism)의 생육을 억제할 뿐 아니라 토양전염성 병해의 침입으로부터 식물을 보호한다. 이와 같은 PGPR의 유익한 기능으로 식물의 생육촉진현상이 일어나는데 건전한 토양조건보다는 식물 생육조건이 불충분한 조건에서의 식물생육촉진이 두드러지게 나타난다. 이들 균주가 생산하는 siderophore에 의한 기능이 잘 알려져 있는데 siderophore는 토양 내에서의 ion 경쟁, chitinase, glucanase 등 병원균의 균사체를 용해할 수 있는 효소 생산 증진 및 항생 기능을 가져 식물병원균을 억제한다. 또한 병원균의 생육을 억제할 수 있는 항생물질 분비에 의한 식물병의 방제효과는 많은 작물과 다양한 병원균을 대상으로 시험되어져 왔다. 최근의 근권미생물에 의한 기작으로서 Kloepper(1992)는 선발된 몇 가지 근권세균을 종자코팅에 의한 방법으로 근권에 정착시켜 오이탄저병 발병의 현저한 감소를 관찰하였다. 또한 PGPR 균주의 토양내 처리만으로도 방제효과를 높일 수 있었다. 이 균주는 오이탄저병균을 억제할 수 있는 항균물질을 생산하지 않는데도 불구하고 오이탄저병을 효과적으로 방제할 수 있었으며 또한 오이 탄저병 이외 수종의 바이러스 병 및 진균 병에 대해서도 방제효과를 나타내었다. Leeman은 형광성 Pseudomonas 길항 세균 중 유전적으로 길항력을 없애거나 siderophore를 생산할 수 없는 균주와 정상균주(wild type)의 ISR 비교 연구를 통하여
항생물질이나 siderophore 등 식물병 방제 관여 물질의 생산 없이도 카네이션의 Fusarium에 의한 시들음병을 방제할 수 있음을 증명하였다. 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.)이 생성하는 시데로포어(siderophores)는 그 세균이 이용하거나 식물 영양에 영향을 미칠 수 있다.
석회질 토양에서는 특히 철 불용성 문제를 시데로포어를 생성하는 형광성 슈도모나드 계통 세균을 도입함으로써 극복될 수도 있다. 인도 G.B. 판드농업기술대학(G.B. Pant University of Agriculture and Technology)의 B. N. Johria 연구팀은 시데로포어를 생성하는 슈도모나스 계통의 GRP3 세균을 사용하여 포트시험으로 미생물 시데로포어가 콩 종류의 하나인
멍빈(mung bean) Vigna radiata L. Wilzeck의 철 영양에서의 역할을 조사하였다. 이들은 호글랜드 용액에 Fe-citrate, Fe-EDTA, Fe(OH)3를 여러 농도로 처리하여 포트실험에 사용하였다. 45일 후 식물은 위황 증상이 줄어들었고, GRP3 세균을 처리한 식물에서는 엽록소 함량이 증가하였다. GRP3 세균처리로 뿌리에서 퍼옥시다제(peroxidase) 활성이 증가하였고 카탈라제 활성이 감소하였다. Fe-citrate를 GRP3와 함께 처리했을 때 엽록소 a, b, 총 엽록소 함량이 대조와 비교해서 각각 34, 48, 39% 크게 증가하였다. 같은 처리에서 퍼옥시다제 활성은 82% 증가했으나 반면 카탈라제 활성은 33% 감소했다. 또한 총 철과 생리적 가용 철이 크게 증가하였다. 엽록소 함량과 퍼옥시다제에서 관찰되는 이러한 경향은 카탈라제의 예외를 제외하고 Fe-EDTA와 Fe(OH)3를 처리한 식물에서도 매우 비슷하게 관찰되었다. 이 시험 자료로 볼 때 멍빈에 GRP3가 있으면 세균이 분비한 시데로포어를 식물이 이용하는 것으로 판단된다고 연구자들은 기술하였다. 시데로포어 생성 체계는 식물에 철 이용성을 개선하는 잠재력을 가지고 있으며, 비료 사용량을 줄여줄 수 있을 것으로 연구자들은 기대하고 있다.
철은 중요한 생화학적 반응을 촉매하는 약 140개 효소들의 조요소로서 식물의 성장과 발달에서 핵심적인 역할을 하며, 생합성 경로의 여러 단계에서 필요한다. 엽록소 생합성은 식물의 철의 순생리이용성 지표로서 생각되고 있다. 카탈라제와 퍼옥시다제는 중요한 전(前)헴 효소로서 철 흡수 연구에서 표식자로 사용될 수 있다.
Siderophore란 철분 포획체로 박테리아와 미생물이 만드는 리간드나 작은 분자들이다.
생체내 대사에 의해 중금속을 제거하는 경우 미생물이 생장하기 위해서는 Cu, Zn, Mn, Co와 같은 금속들인 중금속과 방사선원소들은 미생물에 유해한 영향을 끼친다. 따라서 중금속에 대해서 대사적으로 대응하는 물질로 필수원소가 매우 부족하여 이러한 물질을 저장하고 수송하기 위해서 세포 밖으로 분비된다. Siderophore의 경우 철은 미생물의 대사과정에서 필수원소이고 자연계에서는 Fe3+로 충분히 존재하지만 중성인 조건에서 대부분이 난용성인 Fe(OH)3로 존재하기 때문에 상당히 낮은 농도의 철만이 미생물이 이용할 수 있다. 이러한 물질은 세포밖으로 분비되어 저농도의 철과 결합하여 다시 흡수된다. 그리하여 많은 미생물들이 철이온(Fe3+)의 경쟁에서 우위를 선점하기 위해 경쟁적으로 siderophore를 생산한다.
이런 siderophore에는 catechol type과 hydroxamate type으로 크게 2종류로 분류된다.
Catechol type의 siderophore에는 enterobactin, parabactin, agrobactin, anguibactin,
vibriovactin, azotochelin 등이 있으며,hydroxamate type에는 ferrichrome, ferrioxamine, coprogen, nocardamine 등이 있다. 최근에는 citrate-hydroxamate type의 arthrobactin,
aerobactin, schizokinen과 quinoline type의 pseudobactin, pyoverdin 등이 보고되었다.
미생물에 의한 siderophore의 생산은 철이온(Fe3+)의 경쟁으로 인해 타 미생물의 생육이 억제되기도 하며, siderophore를 생산하는 미생물을 이용해 생물방제에 이용하려는 연구가
활발히 진행되고 있다